基于在位光还原银胶法的核酸碱基快速检测

申浩 申慧彬

摘要：核酸遗传物质是蛋白质合成过程中关键环节，对生物遗传和变异起着关键性作用。核酸碱基多样性特点决定了碱基反应性能，进而发生生物进化和衰老。组合核酸碱基能够得到足够多的信息，是形成高分子生物物质的基础。因此，提出了基于在位光还原银胶法的核酸碱基快速检测。制备表面增强拉曼光谱常规基底，准备核苷酸、核苷、碱基实验材料。制备核酸碱基、硝酸银溶液、银胶溶液和银膜，测量拉曼光谱。使用激光诱导获取银基质，利用NaCIO4分子的CI-O键振动作为内标，分析在位光还原合成银胶法增强光谱效果。由分析结果可知，该方法可以获得高信噪比的表面增强拉曼光谱，且具有良好稳定性，在核酸碱基低浓度检测方面具有实用价值。

关键词：在位光还原;银胶法;核酸碱基;检测

中图分类号：T0041⁺.7 文献识别码：A 文章编号：1001—5922（2021）02—0041—05

0引言

利用焦磷酸序列测定和等位基因特异性扩增方法，可以快速检测核酸碱基。在DNA链扩增和延展过程中，焦磷酸测序是一种基于实时动态检测荧光变化以确定核酸序列的技术。在PCR扩增完成之后，扩增DNA链。脱氧核苷酸和4种特殊酶共同参与DNA序列测定，三磷酸腺苷的作用是消除单个脱氧核苷酸，并不与DNA链相连，从而避免释放单个脱氧核苷酸产生的荧光对信号收集造成的影响，根据荧光未知的DNA序列读取信号，完成核酸碱基检测。此方法无需人工操作，可准确判断单基突变类型，实现定量检测。但也存在着仅能测量短序列DNA的问题;利用等位基因特异性扩增的方法，设计两种PCR引物，其中一种与目标突变体DNA完全互补，或者出现单碱基错配，另一种是引物设计正常。反应分为两组实验，在遇到不匹配的碱基引物时，DNA无法继续延伸。如在待测基因型中有突变，则在跑胶后会出现突变扩增带，而在待测基因型中未发生突变现象，那么就不会产生扩增带，通过这两种现象确定是否存在突变序列。尽管该方法的优点是简单、快速、低成本，但它也存在由于引物只有一个基点，有时会出现放大不正常而导致实验结果不准确的缺陷。

为解决上述问题，提出了一种利用在位光还原银胶法快速检测核酸碱基的方法。采用激光诱导光还原法制备银胶增强基的拉曼光谱信号，并利用拉曼散射增强法对低浓度分子进行检测。

1表面增强拉曼光谱常规基底制备

1.1拉曼光谱分析

拉曼光谱能够反映出分子结构特征，其光谱振动是一个相对薄弱的环节，拉曼光谱散射光强通常只有10-10。常规拉曼光谱的信号强度特别低，激光激发分子产生拉曼散射信号时，常伴有荧光信号。根据以上特点，需要对某些物质进行增强效应研究。

拉曼信号的增强主要有两种方法：一种是以激光作激励光源，其波长与被电子测量物质的吸收波长相近或相等，从而提高被测量物质的拉曼转换概率;另一种是提高分子的拉曼散射截面振动模式，能够增强拉曼散射信号，这就是所谓的共振拉曼效应，但是该效应并不具有表面的特异性，并且溶液中的同种物质可能严重干扰拉曼光谱增强效果;而表面增强拉曼光谱增强效应是一种选择性增强技术，可以检测单分子信号。

1.2常规基底制备

活化基底的制备一直是表面增强拉曼光谱快速检测技术发展的重要因素，对扩大应用效果有重要意义。基片的表面增强拉曼光谱效应与基底的表面强度有密切关系，但仅能在少数基底表面上观测到。由于对分子的拉曼信号具有很大的增强作用，银被用作表面增强拉曼光谱底物。在显微镜下观察银面粗糙度，一般可分为3种类型：①宏观粗糙度，银表面的颗粒尺寸在20-500nm之间;②亚微观粗糙度，银表面的颗粒尺寸在5～20nm之间;③微观粗糙度，银表面颗粒尺寸小于5nm。银表面颗粒粗糙度大于激发光波长，将不会引起拉曼谱效应，但是还没有确定最佳表面粗糙度。一般而言，在50-100nm范围内，粗糙度的提高最大，最佳粗糙度的形成是由于吸附原因造成的，其中大多数是亚微和微细颗粒的形成。

表面增强拉曼散射效应基底应具有表面增强效应强、基底稳定性高、保存期长等优点，表面增强拉曼光谱常规基底制备是表面增强领域的一个重要研究课题。使用金属溶胶法，其是表面增强拉曼散射活性基底之一，由于其制备工艺简单，不需特殊处理，存储方便，增强效果好，所以被选择作为表面增强拉曼散射基底。目前金属溶胶的制备通常采用氧化还原、光化学还原和电化学还原方法，在这些方法中，氧化还原法最为常用。利用柠檬酸钠来还原硝酸银来制备银胶，该过程也是使用硼氢化钠来还原硝酸银，并根据溶胶基体制备条件，以银胶为基体，研究了和生物分子表面增强拉曼谱，并在银基体上检测到拉曼信号。

核酸碱基是核酸的重要组成成分，从碱基基本组成原子上分析，其主要包括氢、碳、氮、氧等元素，这决定了碱基的多种反应性质。碱基会发生一些化学反应，如烷基化，鹵化，反硝化，氰化或加氧。正是因为这些反应，像储存和传递信息这样的生命事件才会发生。由于核酸碱基种类较多，通过不同组合模式能够得到足够多的的信息。

由于碱基类型的多样性，通过适当的组合可以得到足够多信息。

2基于在位光还原银胶法的核酸碱基快速检测实验

2.1实验材料及准备

实验材料选择如表1所示。

将碱基、核苷及核苷酸固体粉末放置在载玻片上，改善玻璃盖压平，并放置在显微镜下调整焦距。借助拉曼光谱仪检测样品。

2.2实验方法

2.2.1核酸碱基、硝酸银溶液制备与拉曼光谱测量

1）将含有腺嘌呤A、胞嘌呤C、鸟嘌呤G、胸腺嘧啶T、尿嘧啶u的核酸碱基溶液注入经过净化系统处理的水中，混合成1×10^-5mol/L溶液。

具体配置流程为：

分别将过量的A、c、G、T、u溶解于5mL水中，将其稀释成吸收值为0.5-1之间的溶液，根据核苷酸分子中不同碱基吸光系数计算饱和溶液，最后将核苷酸分子浓度稀释，得到1×10^-5mol/L溶液。在稀释过程中，将各种样品放置在50%水中溶解一天，能够完全溶解样品。

2）硝酸银溶液制备：将硝酸银溶液溶于净化系统处理后的水中，配制成lmol/L溶液，并依次稀释配制成O.1mol/L，O.01mol/L和0.001mol/L硝酸银溶液。

3）拉曼光谱测量：将制备的核酸碱基溶液与浓度分别为lmol/L、0.1mol/L、0.01mol/L和0.00lmoYL硝酸银溶液混合，倒入内径为0.5mm的石英毛细管之中，使用显微拉曼光谱仪对样品检测，激发光谱波长为500nm，样品照射功率为5mW，曝光时间为15s，迭代次数为15次，由此完成拉曼光谱检测。

2.2.2银胶溶液制备与拉曼光谱测量

1）银胶溶液制备：利用柠檬酸三钠C6H5Na3O7·2H2O还原硝酸银制备银胶溶液，将80mg硝酸银溶于600mL水中，并加热到水沸腾，然后将1%C6H5Na3O7·2H2O水溶液沿着杯壁缓慢滴人硝酸银溶液中，始终保持溶液处于沸腾状态。使用搅拌棒快速、持续搅拌，再静置90min后取出，并将其放在低温避光位置处保存备用。

在银胶溶液制备过程中，为了检测银胶颗粒，需使用紫外监测图谱，随着时间变化，最大吸收峰位置发生改变，峰位先出现向最大吸收峰向长波长方向移动，后又出现向最大吸收峰向短波长方向移动，由此得到大小均匀的银胶颗粒。为了证明该结论，需进行扫描电镜实验，如果扫描结果中银胶颗粒大小在50nm～100nm之间，则说明银胶颗粒是均匀颗粒。

2）拉曼光谱测量：将1×10^-5mol/L核酸碱基溶液与银胶溶液混合，倒入内径为0.5mm的石英毛细管之中，该拉曼光谱测量条件与银胶溶液制备拉曼光谱测量条件一致。

2.2.3银膜制备与拉曼光谱测量

1）银膜制备：使用电子蒸镀机蒸镀银，并将获得的银膜低温避光保存。

2）拉曼光谱测量：为保证核酸碱基溶液制备、硝酸银溶液制备及银胶溶液制备拉曼光谱测量碱基一致，需先将1×10^-5mol/L核酸碱基溶液稀释后直接滴在银膜表面，再使用显微拉曼光谱仪对样品进行拉曼光测量。

3实验结果与分析

将O.1mol/L核酸碱基溶液及1×10^-5mol/L核酸碱基溶液混合，放置在激光波长为480nm，功率大小为0.5W激光下照射，充足照射30min后，在lmL吸水池中使用光谱仪对样品进行紫外可见光扫描，得到的扫描结果如下。

在银胶溶液合成过程中，使用光还原方法获得银胶溶液，这种方法合成的银基质可以得到高信噪比的表面增强拉曼光谱，因此，使用激光诱导获取银基质。

将不同浓度硝酸银和腺嘌呤溶液混合，利用NaCl04分子的C1-O键振动作为内标，研究混合溶液拉曼信号增强效果，如图1所示。

图1中：a、b、c、d分别表示0.5mol/L、5mol/L、50mol/L、500mol/L银离子浓度。在没有银离子存在的情况下，由A、c、G、T、u核酸碱基溶液测量拉曼光谱信号较弱，很难发现特征谱峰。

当银离子浓度升高时，核酸碱基拉曼光谱信号得到了显著提高，从光谱中可以发现其有各自峰值。在一定银离子浓度条件下，核酸碱基混合溶液在激光诱导情况下能够发生光反应，并制备银胶体，由此产生拉曼光谱表面增强效果。

为了研究核酸碱基溶液在银离子作用下拉曼光谱位移变化原因，对腺嘌呤和银离子混合溶液在激光照射下对拉曼光谱时间依赖性和激光强度依赖性展开分析，结果如图2所示。

由图2可知：在激光强度较低的情况下，拉曼峰值逐渐显现出来，由此获得拉曼信号。核酸碱基拉曼信号增强主要原因是当银离子经过激光诱导后，被还原成银颗粒，由此增强核酸碱基拉曼信号。由图2（b）可知，混合溶液拉曼信号强度和位置都没有出现明显变化，足以证明银离子光还原性表面增强拉曼光谱具有一定稳定性。

为了验证在位光还原银胶法制备的表面增强谱具有良好稳定性，需将拉曼光谱峰值、紫外可见光谱峰值与理论峰值进行对比分析，结果如表2所示。

由表2可知：在三次迭代次数下，5种核苷酸分子拉曼光谱峰值与理论峰值基本一致，只是在腺嘌呤1次迭代;胞嘧啶3次迭代;鸟嘌呤2、3次迭代;尿嘧啶1次迭代情况下出现偏差，而在其它迭代次数下均一致。而紫外可见光谱峰值与理论峰值相差较大，由此可知，在位光还原银胶法制备的表面增强谱具有良好稳定性。

4结语

对拉曼散射光谱、紫外可见光谱进行了综合分析，结果表明，在Ag+溶液体系中，拉曼散射光谱信号增强是由于银原子的表面增强所致，而这种增强来自于碱基分子的光还原。经多次测量，拉曼散射光谱的位置和强度都有较大变化。研究发现，在位光还原银胶法制备的表面增强谱具有良好稳定性。

核酸堿基的表面增强拉曼光谱检测还处于较初步的阶段，希望能有足够的时间对其结构影响和核酶变过程进行监测。该技术可以监测核酶的切割过程，为核酸碱基结构形成过程中的折叠过程分析提供数据支持。