壳聚糖基医用补片的制备及其性能研究

刘大庆 高嵩巍 马建伟 陈韶娟

1.青岛大学纺织服装学院，山东 青岛266071；2.江苏丰裕纺织科技有限公司，江苏 南通226010

目前，随着医学和生物材料的不断发展，医用补片在修复人体部位缺陷，如疝气修补、胸壁重建、心包修复、女性盆底重建、肾固定和硬脑膜修补等领域有着广泛的应用[1]。用作医用补片的材料有很多，如根据材料的性质可分为合成材料[2]、生物材料和复合材料等[3-4]。合成补片具有良好的坚韧度和生物惰性，在临床腹壁缺损修补方面应用较多，但使用过程中存在因补片皱缩而引发慢性疼痛及感染等问题[5]。生物补片具有优良的抗感染性，且安全、无毒、可吸收，生物和组织相容性较好，应用前景广阔[6]。复合补片可以实现单一补片难以达到的理想状态，并发挥各自的优点，进而保证在修复过程中组织生长良好，并有效地减少粘连的发生。

壳聚糖(CS)是甲壳素脱乙酰化的产物[7]，属天然的高分子生物材料，在动植物体内及真菌细胞体内大量存在[8]。羧甲基化壳聚糖(CMC)是在壳聚糖分子链上引入羧基而形成的一种衍生物，具有良好的抑菌、抗氧化和止血等功能，其水溶性和重金属螯合作用优于壳聚糖[9-10]。因此，具有良好的生物相容性和可降解性的壳聚糖及壳聚糖基衍生物成为了医学领域常用的生物材料[11]。

壳聚糖具有良好的成膜性，目前多采用传统的延流法制备壳聚糖膜。本文将以完整的梭子蟹蟹壳为原料，在维持梭子蟹蟹壳原有形态的基础上，依次对梭子蟹蟹壳进行预处理，以及浸酸脱钙质、碱煮脱蛋白和浓碱脱乙酰化处理，制备性能优良且完整的壳聚糖膜；然后，以壳聚糖膜为基材，进一步采用氯乙酸法对壳聚糖膜进行羧甲基化处理，制备羧甲基化壳聚糖膜；最后，探究壳聚糖膜和羧甲基化壳聚糖膜的性能，以期为壳聚糖基医用补片的应用提供参考。

1 材料与仪器

1.1 主要材料与试剂

梭子蟹蟹壳(国产)，盐酸(天津市富宇精细化工有限公司)，NaOH(天津市北方天医化学试剂厂)，异丙醇(上海沃凯生物技术有限公司)，无水乙醇(天津市富宇精细化工有限公司)，氯乙酸(天津市大茂化学试剂厂)，蒸馏水(青岛盛天义生物有限公司)。

1.2 主要仪器

FA2204B型电子天平(上海天美天平仪器有限公司)，101-2型鼓风干燥箱(上海市实验仪器总厂)，SHZ-82型水浴恒温振荡器(金坛市实验仪器厂)，HTX-12P型红外线小样染色机(江苏市华夏科技有限公司)，PHS-2C型雷磁pH酸度计(上海市理达仪器厂)，XG-CAM型接触角测量仪(上海轩铁创析工业设备有限公司)。

2 壳聚糖膜和羧甲基化壳聚糖膜的制备

2.1 壳聚糖膜的制备

对梭子蟹蟹壳依次进行预处理、浸酸脱钙质、碱煮脱蛋白和浓碱脱乙酰化处理。

预处理，即将梭子蟹蟹壳放在蒸馏水中清洗干净，去除表面杂质；浸酸脱钙质，即将预处理的梭子蟹蟹壳在温度为25 ℃、体积分数为7%的盐酸溶液中处理24 h；碱煮脱蛋白，即使用质量分数为5%的NaOH溶液在60 ℃条件下对脱钙质后的梭子蟹蟹壳处理4 h；浓碱脱乙酰处理，即采用质量分数为50%的NaOH溶液分别在120、125和130 ℃的条件下对碱煮脱蛋白后的梭子蟹蟹壳处理1.0、1.5和1.5 h，后经超声清洗和鼓风干燥箱干燥，得到壳聚糖膜备用。

2.2 羧甲基化壳聚糖膜的制备

壳聚糖膜的羧甲基化主要包含溶胀、碱化和羧甲基化这3个步骤。溶胀是在室温条件下，将1.0 g制备的壳聚糖膜放入100 mL异丙醇和蒸馏水的混合溶液中反应1 h，其中异丙醇和蒸馏水的体积比为8∶2；接着，将溶胀的壳聚糖膜与质量分数为40%的NaOH溶液在40 ℃的条件下反应4 h，完成碱化过程；然后，向该反应体系中加入15 mL的氯乙酸/异丙醇溶液(氯乙酸与异丙醇质量比为1∶1)，在60 ℃的条件下充分反应，完成壳聚糖的羧甲基化，再经醇洗干燥，获得羧甲基化壳聚糖膜备用。

3 羧甲基化取代度的测定

本试验先称取0.1 g制备的羧甲基化壳聚糖膜，溶解于20 mL、0.1 mol/L的HCl标准溶液中；然后，配置一定量的0.1 mol/L的NaOH标准溶液，每次向HCl标准溶液中滴入1 mL NaOH标准溶液进行滴定，并用PHS-2C型雷磁型pH计(配有E-201-C型pH复合电极)测试pH值的变化，记录NaOH标准溶液体积(mL)与pH值的对应关系，获取电位滴定曲线；最后，根据电位滴定曲线得到滴定终点，再根据式(1)和式(2)分别计算得到羧甲基化取代度kDS[14]。

(1)

(2)

式中：n——单位质量羧甲基化壳聚糖膜中羧甲基物质的量，mol/g；

c——NaOH标准溶液的浓度，mol/L；

V1——滴定HCl标准溶液时消耗的NaOH标准溶液的体积，mL；

V2——滴定—CH2COOH时消耗的NaOH标准溶液的体积，mL；

m——羧甲基化壳聚糖膜的净质量，g。

4 壳聚糖膜及羧甲基化壳聚糖膜基本性能的测试

在医学领域，理想的医用补片应理化性能稳定，具有良好的生物相容性，使用后无炎症和排斥反应；同时应具有良好的溶胀性、吸水性、润湿性及抗菌性等，以便实现伤口处组织液较快吸收，促进组织愈合和增生。本文将就壳聚糖膜及羧甲基化壳聚糖膜的溶胀性、吸水性、润湿性及抗菌性展开测试。

4.1 溶胀性

将壳聚糖膜和羧甲基化壳聚糖膜干燥至恒定质量，裁剪成1 cm×1 cm的试样各3份。先分别称量并记录试样的初始质量m0(g)；再分别将试样浸入pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，室温静置 20 h，将试样取出，用滤纸吸去试样表面水分后称取溶胀后的试样质量m1(g)。根据式(3)计算两种试样各自的溶胀率(kSI)：

(3)

最终试样的溶胀率取各自测试结果的平均值。

4.2 吸水性

室温下，各准备3份一定面积的壳聚糖膜试样和羧甲基化壳聚糖膜试样浸于蒸馏水中，6 h后取出，用滤纸吸去各自表面的水分，称取各自的质量并记录为m′1(g)，然后将试样放入鼓风干燥箱中干燥后称取各自的质量记为m′0(g)。根据式(4)计算两种试样各自的吸水率(Q)：

(4)

最终试样的吸水率取各自测试结果的平均值。

4.3 润湿性

使用XG-CAM型接触角测量仪获取壳聚糖膜试样和羧甲基化壳聚糖膜试样的静态接触角图像与静态接触角数值，以分析壳聚糖膜和羧甲基化壳聚糖膜的表面润湿性能。

具体操作：首先将壳聚糖膜和羧甲基化壳聚糖膜裁剪成平整的小片并固定在玻璃片上，调整好玻璃片在实验台上的位置，将0.2 μL的蒸馏水滴加在小片的表面，此时可以从计算机图像中看到一个清晰的小液滴，3 s时冻结图像将画面固定，然后读取图像中的静态接触角数值。

4.4 抗菌性

采用传统细菌培养、接种的方法进行抗菌性测试。分别称取0.3 g的壳聚糖膜试样和羧甲基化壳聚糖膜试样，在完成培养基配制、试样灭菌处理、菌液配制及试样接种工序后，在其他条件完全相同的情况下，分别将含有壳聚糖膜试样与羧甲基化壳聚糖膜试样的烧瓶及对照组空烧瓶放于水浴恒温振荡器中振荡接触18 h，最后测试烧瓶中大肠埃希菌的细菌浓度。根据式(5)计算试样对大肠埃希菌的抑菌率R(%)：

(5)

式中：x——对照组振荡接触后烧瓶内大肠埃希菌的浓度均值，CFU/mL；

y——试样振荡接触后烧瓶内大肠埃希菌的浓度均值，CFU/mL。

5 结果与分析

5.1 羧甲基化取代度

利用电位滴定法得到羧甲基化壳聚糖膜的电位滴定曲线如图1所示。

图1 羧甲基化壳聚糖膜的电位滴定曲线

由文献[15]可知，碱性条件下，羧甲基会在—OH和—NH2上发生取代反应，且在—OH上的取代多于在—NH2上的取代。kDS<1.00时，表明羧甲基的取代主要发生在—OH上，生成了O-羧甲基化壳聚糖；kDS≥1.00时，表明羧甲基的取代在—OH和—NH2上同时发生，生成了O，N-羧甲基化壳聚糖[16]。

在羧甲基化壳聚糖膜的制备过程中，NaOH和氯乙酸的用量均会对羧甲基化有较大的影响[17]。壳聚糖具有较高的结晶度，反应前需提前进行碱化，以便氯乙酸进入并与之充分反应。当氯乙酸用量过低时，羧甲基化取代反应不彻底；当氯乙酸用量过高时，氯乙酸的利用率会降低。李东华[18]考查了氯乙酸用量、NaOH用量、反应温度和反应时间这4个因素的影响，设计了4因素3水平的正交试验，发现当m(壳聚糖)∶m(NaOH)∶m(氯乙酸)=1.0∶4.5∶1.4时，可制得kDS=1.21的羧甲基化壳聚糖膜。

本试验设定m(壳聚糖)∶m(NaOH)∶m(氯乙酸)=1.0∶20.0∶15.0，足量的氯乙酸能够渗入壳聚糖膜的结晶区中充分反应，使碱化更充分，所制备的羧甲基化壳聚糖膜的取代度为1.86(>1.00)，生成的是O，N-羧甲基化壳聚糖。

5.2 溶胀性和吸水性

溶胀性和吸水性是影响医用补片性能的重要因素。从本质而言，补片的吸水性和溶胀性与材料本身的结晶度和分子链上的亲水基团有关。材料的结晶度越高，则其内部分子排列越规整有序，水分子越难以进入，故其吸水率和溶胀率越低。反之，材料的结晶度越低，则其吸水率和溶胀率越高[19]。

壳聚糖膜试样和羧甲基化壳聚糖膜试样的溶胀率和吸水率结果如图2和图3所示。

图2 壳聚糖膜试样和羧甲基化壳聚糖膜试样的溶胀率

图3 壳聚糖膜试样和羧甲基化壳聚糖膜试样的吸水率

由图2和图3可以看出：与壳聚糖膜试样相比，羧甲基化壳聚糖膜试样的溶胀率和吸水率显著提高，这表明后者在医学应用时更有利于对伤口部位渗出液的吸收，为伤口的愈合提供一个干燥的环境，并有利于抑制伤口部位细菌的滋生。

5.3 润湿性

壳聚糖膜试样和羧甲基化壳聚糖膜试样的静态接触角均值如图4所示。

图4 壳聚糖膜试样和羧甲基化壳聚糖膜试样的静态接触角均值

由图4可以看出：羧甲基化壳聚糖膜试样的亲水性更显著，表明其润湿性更好，这与其吸水率测试结果一致。

5.4 抗菌性

采用10倍稀释法，分别将对照组烧瓶中的菌液、含有壳聚糖膜试样和含有羧甲基化壳聚糖膜试样的菌液稀释3次后，各吸取1mL菌液置于培养皿上，于恒温培养箱中培养24 h，观察培养皿上大肠埃希菌菌落的生长情况(图5)。

a) 对照组菌液

再采用平板计数法计算各平板中细菌的数量，通过式(5)计算壳聚糖膜试样与羧甲基化壳聚糖膜试样的抑菌率，结果如表1所示。

表1 壳聚糖膜与羧甲基化壳聚糖膜的抑菌率

由表1可知，壳聚糖膜试样对大肠埃希菌的抑菌率高达99.0%，抑菌效果显著。壳聚糖膜中含有大量的氨基，在酸性条件下部分氨基质子化以—NH3+的形式存在，可与细菌的细胞膜发生作用，从而起到抑菌的作用。羧甲基化壳聚糖膜对大肠埃希菌的抑菌率为33.9%，有一定的抑菌效果，但与壳聚糖膜相比其抗菌性较低，原因可能与羧甲基化壳聚糖膜的取代度较高，导致能与细菌细胞膜结合的—NH3+减少有关。

6 结论

本文以梭子蟹蟹壳为原料，经稀盐酸和稀碱处理后，去除梭子蟹蟹壳中的钙质和蛋白质等物质，得到甲壳素膜，再经过浓碱脱乙酰化后制得壳聚糖膜，最后壳聚糖膜在低温碱性条件下和氯乙酸发生取代反应，制得了高取代度(kDS=1.86)的羧甲基化壳聚糖膜。

由溶胀性、吸水性、润湿性及抗菌性的测试结果可知，羧甲基化壳聚糖膜具有较好的溶胀性、吸水性和润湿性，对大肠埃希菌具有一定的抗菌性。总体而言，羧甲基化壳聚糖膜在医用补片领域的应用具有广阔的前景，关于其抑菌性能有待做进一步的探索。