染色体异常及AZF缺失与男性睾丸活检无精症的关系

于瑞梅，房 格，王丹丹，辛 瑞，赵 雪，刘 雯

（山东大学附属生殖医院 国家辅助生殖优生工程技术研究中心 生殖内分泌教育部重点实验室 山东省生殖医学重

点实验室 山东 济南 250001）

据世界卫生组织（World Health Organization, WHO）统计，育龄夫妇中约1/10患有不孕不育症，其中男性不育约占50%[1]。无精子症是男性不育的常见原因，约占男性不育症l0%～20%。无精子症包括梗阻性无精子症（obstructive azoospermia, OA）与非梗阻性无精子症（non-obstructive azoospermia, NOA）[2]。OA明确梗阻部位及原因后，可通过外科手术治疗获得子代；NOA发病率占无精子症的40%～60%，原因包括隐睾、免疫学不育、睾丸肿瘤、染色体异常、特发性男性不育等[3]。睾丸活检是诊断NOA的金标准，睾丸活检根据生精细胞阻滞的不同阶段及有无精子可分为三种，包括生精功能低下（hypospermatogenesis, HS），生精功能阻滞（germ cell mature arrest, MA）和唯支持细胞综合征（sertoli cell only syndrome, SCOS）[4]。

研究证实NOA与染色体异常及Y染色体微缺失（azoospermic factor, AZF）关系密切[5]。在精子生成过程中染色体重排会导致染色体异常，染色体异常包括性染色体异常、常染色体异常以及染色体多态等。染色体异常的比例在男性不育中的比例为2.1%～28.4%，在正常人群中的比例为0.7%～1%[6]。AZF定位于Y染色体长臂上（Yq11），存在多种与精子生成相关关键基因位点。该区域包含4个非重叠区域（AZFa、AZFb、AZFc、AZFd）。除克氏综合征外，AZF缺失常认为是引起男性不育最常见细胞遗传学因素[7]。因此，对男性不育患者进行染色体核型分析与AZF缺失检测可明确部分不育患者的病因，并为进一步临床治疗提供科学依据。目前对遗传学异常在男性不育人群中的研究较多，本研究首次对染色体异常核型及AZF缺失在经睾丸活检的NOA中发生率进行了分析。

1.资料与方法

1.1 一般资料

对象来源于2018年10月—2019年12月就诊于山东大学附属生殖医院的门诊患者，病例组203例NOA，根据WHO《人类精液检查与处理实验室手册（第5版）》[8]进行两次以上精液检查均未发现精子患者，经睾丸活检进行病理分型，将已知不育因素排除，如先天性异常、隐睾、辐射、药物、睾丸肿瘤等。病例组共203例，HS组63例，MA 31例，SCOS 109例，对照组选择400例精液参数正常健康男性，对照组接受与NOA相同检查（睾丸活检除外）。所有患者知情同意并经山东大学伦理委员会讨论通过（伦理审批号：2014042）。

1.2 睾丸活检

病例组均通过睾丸体外取精（testicular sperm extraction, TESE），将Bouin, s液保存睾丸活检标本进行病理分析。HS：查见精子；MA：无精子生成，阻滞在生精细胞某个阶段；SCOS：曲细精管内仅查见支持细胞。

1.3 染色体核型分析

无菌条件下将肝素钠抗凝1 mL外周血接种于5 mL 1640培养液中置37℃培养箱培养68～72 h，加秋水仙素2滴，37℃作用1 h 40 min，收获、制片，G显带染色制备标本。采用leica GSL-120全自动扫描分析仪上机扫片，常规计数20个分裂象，分析5个分裂象，发现异常核型时加数到100个分裂象。按人类细胞遗传学国际命名体制（International system for cytogenetics nomenclature 2016, ISCN 2016）进行外周血染色体核型命名。

1.4 Y染色体微缺失分析

抽取患者外周血，提取DNA进行11个序列标签位点（sequence-tagged sites, STS）PCR扩增，向1%琼脂糖中加入1X TAE缓冲液及gene colourⅡ显色剂，室温进行100Ⅴ，40 min凝胶电泳，ZFY和SRY作为STS内参照区域，包括：Ⅰ组（ZFX，sY86，sY127，sY153）；Ⅱ组（ZFX/SRY，sY254，sY134，sY255）；Ⅲ组（RBM1，SRY，sY84，sY152）。采用正常男性和女性做阴/阳性对照，对缺失位点分析。

1.5 统计学分析

2.结果

2.1 染色体异常核型分析

病例组36例（17.7%）染色体异常，对照组3例（0.75%）染色体异常，两组间差异有统计学意义（χ2=64.211，P＜0.01）。在病例组不同病理类型中，染色体核型异常在MA（7/31，22.6%）比例最高。病例组SCOS中，发现18例染色体异常（18/109，16.5%），MA中发现7例染色体异常（7/31，22.6%），HS中发现11例缺失（11/63,17.5%），各病理类型间差异无统计学意义（F=0.614，P＞0.05）。

2.2 AZF缺失分析

病例组有20例（9.9%）AZF缺失，最常见是AZF（c+d）缺失。在病例组SCOS中，9例AZF缺失（9/109，8.3%），MA中9例AZF缺失（9/31，29.0%），HS中2例AZF缺失（2/63,3.2%）。

2.3 染色体异常与AZF联合缺失分析

病例组2例染色体异常联合AZF缺失，病理类型均为MA，见表1。

表1 病例组染色体异常联合AZF缺失分析

3.讨论

研究证实，染色体异常与男性不育关系密切。既往针对男性不育NOA的遗传学研究相对较少[9]，尤其是在NOA不同病理类型中的研究甚少，本文分析了经睾丸活检不同病理类型NOA患者的染色体及AZF缺失发生比例。

结果发现病例组常染色体的异常比例为1.0%，低于男性不育常染色异常比例（1.1%～7.2%），主要为9号染色体倒位，目前9号染色体异常也成为男性不育研究热点，有研究证实9号染色异常与男性不育密切相关，本次9号染色体改变2例，结果提示可能与男性不育相关。病例组性染色体异常比例为8.4%（17/203），与性染色体异常平均比例范围（0.4%～12.3%）一致[10]，其中47，XXY发生比例最高，主要发生在SCOS组，另1例嵌合体发生在MA组，研究认为性染色体嵌合体发生可促进睾丸曲细小管退行性改变，从而抑制精子发生及成熟精子的形成，并可能影响辅助生殖技术成功[11]。染色体多态与男性不育的关系目前尚存争议，本次染色体多态的比例为8.4%（17/203），其中常染色体的1、13、14、21号染色体和Y染色体的多态较常见，其中Yqh±比例较高，说明上述染色体多态的发生可能与男性不育是相关的[9]，但是本研究中发现了染色体多态是分布在各种不同病理类型中的，体外取精后，虽然子代有同样染色体多态的可能性，但是其并不是接受产前遗传学诊断的指征。睾丸活检的NOA染色体异常比例较高，尤其在生精功能较差的SCOS和MA，结果提示可能与男性不育是相关的。

目前，Y染色体对精子生成调节的病因学关系已成为男性不育研究热点，本文病例组有20例（9.9%）发生了AZF缺失，缺失比例与欧洲等国家的比例范围（3.2%～10.5%）相符合，但是低于国内其他地区的研究结果。AZF缺失类型及分布与环境、STS标记、种族因素均有关系，综合分析，AZF在男性不育人群中缺失比例范围为3%～55%[12]。在病例组不同病理类型中，SCOS 9例AZF缺失，MA 9例AZF缺失，HS中2例AZF缺失，SCOS和MA的AZF缺失率明显高于HS，说明SCOS发生AZF缺失可能性更大。AZF（c+d）联合缺失最常见，主要发生在SCOS和MA中，病例组2例发生了染色体异常联合AZF缺失，均为MA，结果提示染色体核型异常及AZF缺失在男性不育症患者中的发生率均较高，联合缺失更常发生在生精功能较差组内。

综上所述，染色体异常和AZF缺失在男性不育中比例较高，尤其是在生精功能较差的SCOS和MA中。睾丸体外取精与辅助生殖技术为不育患者带来生育机会，同时也给其后代带来不育风险，染色体核型分析和AZF缺失的检测对男性不育患者病因的明确尤为重要，进行联合检测将有助于男性不育症患者病因的发现，也有助于进一步治疗，同时也为男性不育患者的诊治以及遗传咨询提供科学依据，其意义重大。