清肺理痰方对COPD模型大鼠呼吸功能的影响及其机制

朱汉平 王鹏 李振球 潘俊辉 谢栩硕 刘小虹 张晓芸

(1 广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405；2广州医科大学附属第一医院中医科；3广州市中医院中医科)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是以不完全可逆的气流受限为特征的一种慢性疾病状态〔1〕。在全世界范围内COPD的发病率和死亡率仍然呈逐年增加的趋势，预计至2020年将上升为世界三大致死病因之一〔2〕。COPD是以呼吸系统慢性炎症为主要特征，炎症细胞浸润可导致黏液分泌增加，而黏液分泌增加又导致炎症反应加重，与COPD进展密切相关〔3〕。清肺理痰方是在痰热壅肺证型的方药基础上衍生而成，具有清热化痰、宣肺止咳的功效，最初在临床上用于肺炎喘嗽并取得显著疗效，临床实践发现清肺理痰方对COPD也具有较好的临床疗效，但是具体机制尚不明确。本文探讨清肺理痰方对COPD大鼠的保护作用，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1动物 SD大鼠共50只，SPF级，雄性，6～8周龄，体重180～220 g，由广州中医药大学动物实验中心提供，动物合格证号为SCXK(粤)2013-0034。实验开始前先适应性喂养1 w，给予标准啮齿动物饲料，整个实验中大鼠自由饮水和进食。

1.1.2主要试剂及药品 水合氯醛(青岛宇龙海藻有限公司)，脂多糖(美国Sigma公司)，丙二醛(MDA)检测试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒和Lysis Buffer裂解液(上海碧云天公司)，白细胞介素(IL)-8检测试剂盒和肿瘤坏死因子(TNF)-α检测试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)，Trizol 总 RNA 提取试剂盒、Super Real Pre Mix Plus(SYBR Green)试剂〔天根生化科技(北京)有限公司〕，Affymetrix 逆转录试剂盒(美国Qiagen公司)。基质金属蛋白酶(MMP)-9、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)-1、Janus激酶(JAK)-1和信号传导与转录激活子(STAT)-3及内参β-actin引物设计与合成由天根生化科技(北京)有限公司完成。清肺理痰方(石膏 30 g，鱼腥草 20 g，瓜蒌皮、黄芩、浙贝母、芦苇茎、桔梗各 15 g，青天葵、北杏仁、甘草各10 g)：取药材浸泡2 h，加10倍量水煎煮2 h过滤，再加8倍量水煎煮2 h，过滤混合两次滤液，浓缩后4℃保存(每1 ml含生药4 g)，分装灭菌，冷藏备用。临用前等倍稀释。

1.1.3主要仪器 口鼻式吸入暴露染毒系统、香烟烟雾发生器(柴田科学株式会社)，Buxco动物肺功能分析系统(北京华运安特科技有限责任公司)，紫外可见分光光度仪(德国Eppendorf公司)，ABI step one荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，GeneGenius全自动凝胶成像系统(美国Syngene公司)。

1.2实验方法

1.2.1分组与造模 所有大鼠随机分为5组，每组10只。各组大鼠于实验第1、14天腹腔注射2%戊巴比妥钠进行麻醉。正常对照组大鼠用静脉套管针在气管内注入200 μl生理盐水。其他组大鼠在气管内注入脂多糖(200 μg/200 μl)，以轴位旋转大鼠数次，并且早晨在口鼻式吸入暴露染毒系统内持续熏吸香烟烟雾30 min。

1.2.2给药方法 清肺理痰方大、中、小剂量组于实验第2～13天，第15～30天分别灌胃给予8 g/kg、4 g/kg和2 g/kg清肺理痰方药液，正常对照组和模型对照组大鼠分别灌胃给予同体积的纯净水。5组大鼠的疗程均为4 w。

1.3观察指标

1.3.1肺功能的测定 实验最后1 d各组大鼠灌胃后1 h腹腔注射2 %戊巴比妥钠进行麻醉，气管插管后采用肺功能检查仪器测定用力肺活量(FVC)，0.3 s用力呼气容积(FEV0.3)和最大呼气流量(PEF)，计算FEV0.3/FVC。

1.3.2血清IL-8和TNF-α的测定 各组大鼠腹主静脉取血2 ml，室温下静止30 min，离心，分离得血清。采用酶联免疫吸附试验测定IL-8和TNF-α水平。测定过程严格按照说明书执行。

1.3.3肺组织MDA和SOD含量的测定 取各组大鼠双肺于-80℃冰箱中保存。取左肺加生理盐水制备10%组织匀浆，离心，分离得上清液。采用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白含量，采用分光光度法测定组织中MDA、SOD 含量。测定过程严格按照说明书执行。

1.3.4肺组织MMP-9、TIMP-1、JAK-1和STAT-3 mRNA的测定 取右肺组织在液氮中研磨后加Trizol试剂提取总RNA。以总RNA为模板，逆转录得cDNA。逆转录条件：16℃ 30 min；42℃ 30 min；85℃ 5 min。纯化cDNA后进行PCR扩增。PCR反应体系：1 μl cDNA 模板，目标基因上游引物和下游引物各1 μl，10 μl Super Real Pre Mix Plus，7 μl H2O。各引物序列如下：MMP(5′-GAT CCC CAG AGC GTT ACT CG-3′，5′-GTT GTG GAA ACT CAC ACG CC-3′)，TIMP-1(5′-ACG CTA GAG CAG ATA CCA CG-3′，5′-GCC CTT ATA ACC AGG TCC GAG-3′)，JAK-1(5′-ATG GAG TTT CTG CCT TCG GG-3′，5′-CTC CGG AGC GTA CCA AAA CA-3′)，STAT-3(5′-AAA GTA TTG TCG CCC CGA GA-3′，5′-CAG GTC GTT GGT GTC ACA CAG-3′)和GAPDH(5′- CGT TGA CAT CCG TAA AGA CC TC-3′，5′- TAG GAG CCA GGG CAG TAA TCT-3′)。PCR反应条件：95℃预变性10 s，然后以95 ℃ 30 s、60℃ 60 s，37 个循环。以GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt计算目标基因的相对表达量。

1.4统计学方法 采用SPSS22.0软件进行F检验，单因素方差分析，LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组大鼠肺功能比较 模型对照组大鼠FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC和PEF均较正常对照组显著降低(P<0.05)。清肺理痰方中、大剂量组FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC和PEF均较模型对照组显著升高(P<0.05)，清肺理痰方可剂量依赖性升高COPD大鼠FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC和PEF水平(P<0.05)。见表1。

2.2各组大鼠血清IL-8、TNF-α、肺组织MDA、SOD水平比较 模型对照组大鼠血清IL-8、TNF-α、肿组织MDA均较正常对照组显著升高，SOD显著降低(P<0.05)。清肺理痰方中、大剂量组血清IL-8、TNF-α、肺组织MDA均较模型对照组显著降低，SOD显著升高(P<0.05)，清肺理痰方可剂量依赖性降低COPD大鼠血清IL-8、TNF-α、肺组织MDA水平，升高SOD水平(P<0.05)。见表2。

组别IL-8(ng/L)TNF-α(ng/L)MDA(mmol/mg)SOD(U/mg)正常对照组198.35±13.49259.29±18.6136.47±3.65216.81±19.64模型对照组367.13±24.651)386.38±21.291)78.81±8.761)89.46±9.871)清肺理痰方小剂量组355.45±25.31379.25±23.8775.23±8.4993.25±11.25清肺理痰方中剂量组297.36±22.842)3)321.57±21.852)3)61.27±8.152)3)119.38±14.892)3)清肺理痰方大剂量组253.68±17.492)3)4)289.86±19.692)3)4)49.75±7.472)3)4)154.67±16.842)3)4)F/P值110.227/<0.00168.523/<0.00154.755/<0.001124.891/<0.001

2.3各组大鼠肺组织MMP-9、TIMP-1、JAK-1和STAT-3 mRNA比较 模型对照组大鼠肺组织MMP-9、JAK-1和STAT-3 mRNA均较正常对照组显著升高，TIMP-1 mRNA较正常对照组显著降低(P<0.05)。清肺理痰方中、大剂量组肺组织MMP-9、JAK-1和STAT-3 mRNA较模型对照组显著降低(P<0.05)，TIMP-1 mRNA显著升高(P<0.05)；清肺理痰方可剂量依赖性降低COPD大鼠肺组织MMP-9、JAK-1和STAT-3 mRNA水平，升高TIMP-1 mRNA水平(P<0.05)。见表3、图1。

1～5：正常对照组、模型对照组、清肺理痰方小剂量组、清肺理痰方中剂量组、清肺理痰方大剂量组图1 PCR凝胶电泳

3 讨 论

COPD属于中医学的肺胀、喘病和咳嗽等以肺脏病变为主的肺系疾病范畴。COPD因感受风热或痰郁化热，迁延失治，耗伤气阴，痰瘀互阻。清肺理痰方具有清热宣肺、化痰散瘀、益气润肺的功效，适用于COPD，痰热瘀阻之证候〔4〕。本研究结果提示清肺理痰方可显著改善COPD大鼠的肺功能。

目前认为COPD的发病机制主要集中在炎症反应、氧化应激、蛋白酶/抗蛋白酶失衡等方面〔5〕。COPD以慢性炎症为主要特征，发生发展与炎症密切相关。TNF-α与IL-8共同参与COPD的炎症反应，TNF-α具有多种前炎性介质的功能，主要参与气道炎症形成时中性粒细胞活化，加重炎症症状使气道结构重塑，最终导致气道结构破坏〔6〕。IL-8是一种重要的炎症介质，可参与中性粒细胞和淋巴细胞的聚集与活化，并可导致IL-8的进一步释放〔7〕。本研究结果说明清肺理痰方可降低COPD大鼠血液IL-8和TNF-α。

氧化应激是COPD的核心发病机制之一，正常情况下肺内细胞通过抗氧化系统的作用保持氧化/抗氧化平衡。长期暴露于有害颗粒或气体时COPD患者机体氧化能力和抗氧化能力的平衡被打破〔8〕。目前认为细胞毒性产物 MDA 可以反映 COPD组织细胞氧化损伤程度，SOD 则是重要的抗氧化酶，其活性也反映出细胞氧化应激的受损程度〔9〕。本研究结果说明清肺理痰方可降低COPD大鼠肺组织MDA并升高SOD。

近年来研究发现JAK/STAT信号通路参与细胞增殖、分化。JAK激酶是一种非受体型酪氨酸激酶，STAT是JAK下游的转导子和转录激活子，体内部分细胞因子由胞膜向核内进行信号传递，与STAT受体结合后可激活信号通路〔10〕。JAK/STAT信号转导通路在COPD的发病机制中发挥重要的作用。激活JAK/STAT信号通路后可介导炎性细胞因子积聚，促进炎症反应发生和发展，产生一系列的临床症状〔11〕。本研究结果说明清肺理痰方可调节慢性阻塞性肺疾病证大鼠肺组织JAK1/STAT3通路。

MMPs与TIMPs参与调节组织炎症的过程，MMPs和TIMP的表达失衡可导致细胞外基质沉积症退化，导致气道损伤及肺气肿〔12〕。MMP-9 是 MMPs 家族中的一员，TIMP-1 是 MMP-9 的内源性抑制剂，TIMP-1是 MMP-9的体内抑制剂，通过抑制MMP-9活性降低MMP-9破坏基质程度〔13〕。因此，MMP-9及TIMP-1的浓度变化与气道炎症损伤有关。本研究结果说明清肺理痰方可调节COPD大鼠肺组织MMP9/TIMP1 mRNA表达。