褪黑素通过抑制程序性细胞坏死对心肌缺血再灌注的保护作用

杨吉平 费琳 柴学军 祁存芳,3

(1西安医学院基础医学研究所 陕西省缺血性心血管疾病重点实验室，陕西 西安 710021；2西安交通大学第一附属医院精神心理科；3青海大学医学院解剖教研室)

缺血再灌注损伤(IRI)常引起患者出现多种并发症，甚至死亡，是心肌缺血临床治疗效果不佳的主要原因，应用外源性药物预防和治疗是防止心肌细胞进一步损伤的重要策略，但是由于药品的筛选、来源和副作用等问题，至今仍然未获得效果满意的药物和干预方法〔1〕。因此，探寻人体内源性具有抗心肌缺血损伤的物质成为目前心肌保护方面的研究热点之一。褪黑素(MLT)是由松果体产生的一种吲哚类激素，近年研究发现，它不仅对中枢神经系统的生物节律有调控作用，而且对心血管系统在生理和病理条件下也具有调节作用〔2〕，还对脑、心、肝和肾等器官的缺血损伤有明显的保护作用〔3～6〕，因此，MLT已经成为近年保护心肌损伤领域的一个很有潜力的药物。但是MLT抗心肌 IRI的机制尚未完全阐明，成为限制其进一步研发和应用的瓶颈。为此，本研究从程序性细胞坏死分子机制的角度出发，观察MLT对大鼠心肌IRI的保护作用。

1 材料和方法

1.1实验动物及分组 Wistar雄性大鼠40 只，220～250 g，购自西安交通大学实验动物中心，随机分4组，每组10只。模型组给予建立心肌IRI模型，给药组是在IRI模型的基础上在缺血前30 min及缺血后30 min，分2次腹腔注射MLT溶液，MLT低、高剂量组分别按1 mg/kg 和5 mg/kg 给予。假手术组只开胸不结扎。

1.2试剂及仪器 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染料和肌酸激酶(CK)活性检测试剂盒购自北京 Solarbio 生物公司，Western印迹电泳仪和转膜仪购自 Bio-Rad 公司。兔抗RIPK3 抗体购自 Abcam 公司，磷酸化人混合系列蛋白激酶样结构域(MLKL)抗体购自 Milipore 公司，GAPDH 抗体购自武汉三鹰生物公司。MLT购自 Sigma 公司，使用前将MLT 5 mg 加 0.1 ml 二甲基亚砜溶解后，再用生理盐水定容至 1 ml，4℃ 保存备用。

1.3心肌IRI模型的建立 将大鼠用2%戊巴比妥钠 40 mg/kg 腹腔注射麻醉，仰卧位固定，行气管插管后接人工呼吸机，呼吸频率调为 55 次/min，潮气量约 25 ml/kg，四肢连接心电图机。胸骨左侧纵行切口，于第 3 肋间隙分离肋间肌，进入纵隔，剪开心包膜，暴露心脏，以左冠状静脉为定位点，于左心耳根部下方约 2 mm 处进针，从肺动脉圆锥旁出针，用 5 号丝线结扎左冠状动脉前降支，以心电图Ⅱ导联出现 S-T 段明显抬高或 T 波高耸，心尖变白作为结扎成功的标志，缺血 50 min 后松开线结再灌注 3 h，即为大鼠心肌IRI模型建立。

1.4心肌梗死面积测定和苏木素-伊红(HE)染色 取新鲜大鼠心脏于-80℃冷冻50 min后，以结扎冠状动脉的部位为分界，从心尖处开始横切，基本垂直于心脏纵轴方向，每个心脏共切6片，片厚约1 mm，然后置于37℃，避光，1%TTC染液中，染色20 min，用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后再用4%多聚甲醛固定24 h，拍照，用Image J软件测量每组的梗死面积。各组另取1只大鼠麻醉后，用0.1 mol/L PBS彻底冲出循环内的血液，用4%多聚甲醛进行灌流固定，取出心脏后用4%多聚甲醛4℃后固定12 h，然后石蜡包埋，切片，进行常规HE染色，对比观察各组心肌细胞和心肌结构的改变情况。

1.5血清CK活性的测定 大鼠IRI手术结束后，经左心室取全血1 ml，分离出血清，按 CK 活性检测试剂盒说明书步骤进行操作，最后用酶标仪在波长 340 nm 处测定每组血清的吸光度 A 值。在 37℃，pH7.0 条件下，1 ml 血清每分钟催化产生1 nmol NADPH 为一个 CK 酶的活性单位。CK 活性值(U/ml)的计算按产品说明书给出的公式。

1.6Western印迹检测 大鼠处死后，开胸暴露心脏，在冰上快速取出各组大鼠左心室前壁心肌组织少许，置于 1.5 ml EP 管中，每管加入 RIPA(pH 7.4)200 μl，超声裂解 20 min，4℃，12 000 r/min，离心 15～20 min；将上清液转移至另一个 EP 管中，BCA 法蛋白定量后上样，每孔15 μl,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后湿转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂奶粉封闭 1 h后 TBST 漂洗 3 次，然后分别加入 RIPK3(1∶200)、pMLKL(1∶500)和 GAPDH(1∶3 000)，4℃孵育过夜，TBST 漂洗 3 次，加辣根过氧化物酶(HRP)标记的相应二抗(1∶5 000)，室温孵育2 h，TBST 漂洗 4 次后 ECL发光，对各组蛋白表达的条带灰度对比分析。

1.7统计学方法 采用SPSS19.0软件行t检验。

2 结 果

2.1MLT对心肌梗死面积的影响 将大鼠的心肌组织切片行 1% TTC染色后，心肌未梗死区域呈红色，梗死区域呈现苍白色，结果显示，心肌梗死区与左冠状动脉前支供血区域基本吻合，提示造模成功。模型组大鼠心肌梗死面积明显高于假手术组(P<0.01)。MLT低剂量干预后，有降低梗死面积的趋势，但统计学差异不明显(P>0.05)；MLT高剂量则显著减小缺血再灌注所致的梗死面积(P<0.01)。模型组血清 CK活性较假手术组明显升高(P<0.01)。MLT干预后，血清CK活性较模型组明显降低(P<0.05)，且随着MLT浓度的升高，CK活性的下降更加显著(P<0.01)，见表1。

表1 MLT对IRI的梗死面积和CK活性的影响

模型组心肌纤维明显紊乱，呈波浪状弯曲，或皱缩，甚至溶解，细胞间可见大量的炎性细胞浸润、水肿，心肌肌质凝固、伊红染色增强。MLT低剂量干预后，有改善病变的趋势，但仍然可见凝固性收缩带，横纹不清或消失，心肌纤维粗大。MLT高剂量能明显抑制心肌结构的上述病理变化，心肌坏死灶明显好转，仍可见炎细胞浸润等。见图1。

图1 心肌缺血再灌注损伤后的心肌组织结构变化(HE染色，×400)

2.2MLT可抑制心肌IRI后程序性坏死关键蛋白的表达 Western印迹结果显示，假手术组大鼠心肌组织中几乎不表达 RIPK3 和 磷酸化MLKL蛋白，而当发生IRI后，如图2所示，与假手术组相比，模型组大鼠心肌损伤区的 RIPK3 和磷酸化 MLKL 蛋白的表达均明显上调(P<0.01)。与模型组比较，MLT低剂量组大鼠心肌损伤RIPK3 和磷酸化 MLKL蛋白表达降低(P<0.05)，而MLT高剂量组可使这两种蛋白表达显著下调(P<0.01)。见表2。

1～4：假手术组、模型组、MLT低剂量组、MLT高剂量组图2 MLT对大鼠心肌IRI后 RIPK3 和 pMLKL 蛋白表达的影响

表2 MLT 对大鼠心肌 IRI 后 RIPK3 和 pMLKL 蛋白表达的影响

3 讨 论

冠状动脉病变所致的缺血性心脏病事件逐年升高，再灌注治疗仍然是目前临床上治疗缺血性心血管疾病最有效的手段，主要通过药物溶栓、经皮冠状动脉介入治疗和冠状动脉搭桥术使冠状动脉再通重新恢复血供。然而，再灌注是一把“双刃剑”，一方面可以使缺血心肌恢复血液供应，另一方面会形成新的损伤，即IRI〔7〕。目前关于心肌IRI的研究主要集中在能量代谢障碍致氧自由基增多，细胞内钙超载和继发性炎症反应等方面，但具体损伤机制仍不十分清楚〔8〕。研究发现，由 RIPK1/RIPK3/MLKL 介导的程序性坏死在心肌 IRI 中发挥着重要作用，应用 Necrostatin(Nec)-1能显著减轻实验动物的心、脑、肾和视网膜等器官的缺血性损伤〔9～11〕，因此，程序性坏死抑制剂有希望成为抗IRI的靶点药物。RIPK3、MLKL的募集和磷酸化是程序性坏死信号通路中最重要的两种蛋白质，本研究结果表明IRI可诱发心肌细胞发生程序性坏死。

MLT生理状态下，体内含量极小，一般在pmol/L水平。MLT的生物学功能主要有清除氧自由基抗衰老，调节生物钟促进睡眠，调节免疫、抗肿瘤等方面，常常作为保健性的膳食补充剂被广泛应用。随年龄的增长，松果体的钙化不断增加，60岁时松果体的钙化率为64%～69%，故老年人的血浆MLT水平更低，然而老年人冠状动脉供血不足常常患病率很高且严重〔12〕。有研究发现冠状动脉旁路移植术后心肌 IRI 的程度与患者血浆中MLT的水平呈负相关，MLT的含量越高，心肌 IRI 的程度就越轻〔13〕。已知心肌缺血再灌注时程序性坏死显著增强，MLT保护缺血再灌注诱发的心肌损伤作用是否与其抑制程序性坏死有关是本研究的切入点。本研究结果表明高剂量MLT能保护心肌细胞的IRI。MLT可通过抑制程序性细胞坏死从而发挥IRI的保护作用。综上，MLT为人体的一种内源性物质，几乎无不良反应，倘若能进一步应用于缺血再灌注性疾病的治疗当中，将可能给更多的患者带来好处。