老年乳腺癌组织中HER-2、GCDFP15及Calponin表达与术后复发转移的关系

简华勇 李廷超 (遵义医科大学第三附属医院(遵义市第一人民医院) ，贵州 遵义 563000)

手术是乳腺癌常用治疗手段，手术本身具有较好干预效果，可有效切除病灶，延长患者生存时间，但仍有部分患者术后会发生复发、转移，影响整体治疗效果，增加预后风险〔1〕。因此，早期预测乳腺癌术后复发转移风险，对指导早期干预，减少术后复发转移意义重大。随着研究深入，人表皮生长因子受体(HER)2被证实可作为乳腺癌的独立预后因素，且有研究显示该基因表达情况与淋巴结转移存在密切联系，可能参与了术后癌细胞复发转移〔2〕。巨囊性病液体蛋白(GCDFP)15为乳腺囊液组成蛋白，因正常乳腺导管小叶基本不分泌GCDFP15，且既往研究显示该蛋白对乳腺癌具有较高诊断价值，故猜测GCDFP15可能参与了术后癌细胞的复发与转移〔3,4〕。钙调理蛋白(Calponin)属于细胞骨架类蛋白，以往的研究着重观察钙蛋白在细胞收缩方面的作用，但近年来研究显示，Calponin在肿瘤发展过程中也有重要作用〔5〕。本研究旨在分析HER-2、GCDFP15及Calponin表达与老年乳腺症患者术后复发转移的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾分析遵义市第一人民医院2017年6月至2020年6月经病理组织确诊并完成治疗与随访的80例老年乳腺癌组织标本、61例结节性乳腺囊肿组织标本及41例癌旁正常组织标本。乳腺癌组年龄63～75岁，平均(69.51±3.52)岁；体重指数(BMI)17.6～24.8 kg/m2，平均(21.26±1.25)kg/m2。结节性乳腺囊肿组年龄63～76岁，平均(69.58±3.42)；BMI 17.7～24.9 kg/m2，平均(21.36±1.34)kg/m2。癌旁正常组年龄63～74岁，平均(68.95±3.49)岁；BMI 17.5～24.6 kg/m2，平均(21.06±1.54)kg/m2。3组基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，有可比性。

1.2入选标准 纳入标准：①乳腺癌符合《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范(2015版)》〔6〕中乳腺癌诊断标准，结节性乳腺囊肿患者均经超声检查证实，且均经病理组织切片确诊；②年龄≥60周岁；③临床影像学资料、实验室检查资料、病例资料均完整。排除标准：①心、肝、肾等重要脏器功能异常；②合并其他恶性肿瘤；③凝血功能异常；④合并免疫系统疾病。

1.3免疫组化法 取手术标本用4%中性甲醛固定液进行固定，石蜡包埋处理后，常规切4 μm切片；将石蜡切片用二甲苯脱蜡后，添加适量5%双氧水，于常温环境下孵育10 min，再用磷酸盐缓冲液孵育5 min；孵育结束用蒸馏水冲洗3次(5 min/次)，置入含5% 山羊血清抗体内封闭，10 min后直接滴加一抗(鼠抗人HER-2抗体、单克隆鼠抗GCDFP15抗体、鼠抗人Calponin抗体，均购自基因科技股份有限公司)，于4℃冰箱内孵育过夜后，用蒸馏水冲洗3次(5 min/次)；滴加生物素标记的二抗(购自基因科技股份有限公司)，于37℃环境下孵育30 min，用蒸馏水冲洗3次(5min/次)；滴加用二代辣根酶标记的工作液体，于37℃环境下孵育10 min，孵育结束后用蒸馏水冲洗3次(5 min/次)；显色后用酒精进行脱水，二甲苯透明及树胶封片，最后于显微镜(购自日本奥林巴斯公司，型号：BX53)下观察染色结果。

1.4结果判读 ①HER-2阴性：无癌细胞染色或≤10%癌细胞呈现不完整细胞膜染色；阳性：>10%的癌细胞呈不完整或完整的细胞膜染色；染色强度微弱、一般或强。②GCDFP15阴性：细胞质内无染色；阳性：细胞质着色呈棕黄色，且阳性细胞占比>5%。③Calponin阴性：肌上皮细胞或部分间质细胞的细胞质无着色，且无阳性细胞；阳性：肌上皮细胞或部分间质细胞的细胞质着色，可见阳性细胞。

1.5基线资料收集法 设计临床资料调查问卷，记录老年乳腺癌患者基线资料〔包括年龄、BMI、合并症(糖尿病：空腹血糖水平>7.0 mmol/L；高血压：收缩压水平≥140 mmHg，舒张压水平≥90 mmHg；高脂血症：低密度脂蛋白胆固醇水平>130 mg/dl)、临床分期(Ⅰ～Ⅳ期)等〕及实验室指标〔HER-2(阳性、阴性)、GCDFP15(阳性、阴性)、Calponin(阳性、阴性)〕。

1.6统计学方法 采用SPSS23.0软件进行Shapiro-Wilk正态性检验、单因素方差分析、χ2检验、秩和检验及多项Logistic回归分析；绘制受试者工作特征(ROC)曲线，并计算曲线下面积(AUC)值，AUC值>0.90表示预测性能较高，0.71～0.90表示有一定的预测性，0.50～0.70表示预测性能较差，以检验HER-2、GCDFP15、Calponin表达预测术后淋巴结转移的价值。

2 结 果

2.13组HER-2、GCDFP15、Calponin表达比较 乳腺癌组、结节性乳腺囊肿组HER-2与GCDFP15阳性率高于癌旁正常组，Calponin阳性率低于癌旁正常组，乳腺癌组HER-2与GCDFP15阳性率高于结节性乳腺囊肿组，Calponin阳性率低于结节性乳腺囊肿组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 3组HER-2、GCDFP15、Calponin表达比较〔n(%)〕

2.2复发转移组与未复发转移组基线资料比较 80例老年乳腺癌患者随访结束，24例(30.00%)发生复发转移。两组年龄、BMI、合并疾病、临床分期差异无统计学意义(P>0.05)；复发转移组HER-2阳性、GCDFP15阳性、Calponin阴性均高于未复发转移组，HER-2阳性、GCDFP15阳性、Calponin阴性可能与老年乳腺癌患者术后复发转移有关(P>0.05)。见表2。

组别n年龄(岁)BMI(kg/m2)合并疾病〔n(%)〕糖尿病(n=29)高血压(n=27)高脂血症(n=25)HER-2阳性〔n(%),n=52〕复发转移组2469.24±3.2421.34±1.259(31.03)8(29.63)6(24.00)20(38.46)无复发转移组5669.62±3.2521.22±1.2420(68.97)19(70.37)19(76.00)32(61.54)t或χ2值0.3530.3960.0230.0030.6235.065P值0.7250.6930.8790.9590.4300.024组别n临床分期〔n(%)〕Ⅰ期(n=13)Ⅱ期(n=23)Ⅲ期(n=29)Ⅳ期(n=15)GCDFP15阳性〔n(%),n=57〕Calponin阳性〔n(%),n=22〕复发转移组245(38.46)6(26.09)10(34.48)3(20.00)21(36.84)2(9.09)无复发转移组568(61.54)17(73.91)19(65.52)12(80.00)36(63.16)20(90.91)χ2/P值0.636/0.5254.420/0.0366.317/0.012

2.3HER-2、GCDFP15、Calponin表达对老年乳腺癌术后复发转移影响的回归分析 将HER-2、GCDFP15、Calponin表达作为自变量并赋值，HER-2阳性=1，阴性=0；GCDFP15阳性=1，阴性=0；Calponin阴性=1，阳性=0。将老年乳腺癌患者术后复发转移情况作为因变量(1=复发转移，2=未复发转移)，经多项Logistic回归分析结果显示，HER-2阳性、GCDFP15阳性、Calponin阴性是老年乳腺癌患者术后复发转移的影响因素(OR>1，P>0.05)。见表3。

表3 术后复发转移的影响因素多因素分析结果

2.4HER-2、GCDFP15、Calponin表达预测老年乳腺癌患者术后复发转移的价值 将术后复发转移情况作为状态变量(1=复发转移，2=未复发转移)，将HER-2、GCDFP15、Calponin表达作为检验变量(HER-2：1=阳性，0=阴性；GCDFP15：1=阳性，0=阴性；Calponin：1=阴性，0=阳性)，绘制ROC曲线(图1)显示，HER-2阳性、GCDFP15阳性、Calponin阴性预测术后复发转移的AUC分别为0.807(AUC 95%CI：0.696～0.918，P<0.001)、0.857(AUC 95%CI：0.762～0.952,P<0.001)、0.833(AUC 95%CI：0.380～0.928，P<0.001)，均>0.80，有一定预测价值。

图1 HER-2、GCDFP15、Calponin表达预测老年乳腺癌患者术后复发转移风险ROC曲线

3 讨 论

作为女性常见恶性肿瘤，乳腺癌的发病机制尚未明确，多认为与遗传、乳腺良性疾病未治愈等因素有关〔7〕。目前临床治疗乳腺癌多采用外科手术，手术虽可将肿瘤病灶有效切除，但术后仍有复发转移风险，不利于患者预后〔8〕。因此，早期预测乳腺癌术后复发转移风险是临床早期干预，改善患者预后的关键。

随着分子生物技术发展，分子病理学在乳腺癌的诊断、干预及预后评估中得到重视〔9〕。HER-2作为乳腺癌基因，其在乳腺癌中的作用已得到证实，且现已成为肿瘤靶向药物治疗新靶点〔10〕。HER-2过表达除了会增加肿瘤细胞侵袭能力外，还会促进淋巴血管新生，增加淋巴结转移风险，同时可降低肿瘤细胞对化疗药物敏感性，影响整体干预效果，继而增加术后复发风险〔11，12〕。本研究结果提示乳腺癌患者病理组织中HER-2表达增高；经回归分析并绘制ROC曲线结果证实HER-2过表达参与了乳腺癌术后复发转移。GCDFP15多被作为大汗腺标志物，主要由大汗腺、泌乳腺等腺体分泌而来，因多种乳腺病变均存在大汗腺分化表现，且有研究显示乳腺癌组织中GCDFP15过表达，故GCDFP15被临床作为乳腺癌诊断特异性指标〔13，14〕。因乳腺癌术后复发转移可能会影响乳腺囊液分泌，继而影响GCDFP15表达情况，故猜测可将GCDFP15作为乳腺癌术后复发转移风险的预测指标〔15〕。作为细胞骨架类蛋白，Calponin根据电点的不同可分为H1-Calponin、H2-Calponin、H3-Calponin 3种亚型，其中H2-Calponin广泛存在于内皮细胞、平滑肌细胞等细胞中〔16〕。有研究显示，H2-Calponin表达增加是肿瘤预后的一个积极因素〔17〕。王华等〔18〕研究发现，下调的H2-Calponin可促进食管鳞癌细胞增殖、转移。由此可见，Calponin阴性可能会增加乳腺癌术后复发转移风险。本研究结果提示乳腺癌患者GCDFP15表达增加，Calponin表达下调；经回归分析并绘制ROC曲线结果证实GCDFP15、Calponin表达也与老年乳腺癌术后复发转移有关，且可作为乳腺癌术后复发转移风险的另一预测指标。

综上，老年乳腺癌患者术后仍有复发转移风险，可能与组织中HER-2过表达、GCDFP15过表达、Calponin表达下调有关，检测老年乳腺癌患者HER-2、GCDFP15、Calponin表达，对预测患者术后复发转移风险与指导早期防治干预计划拟定有积极意义。