“金花”散茶中可溶性碳水化合物的浸提及测定方法比较

向 阳，刘 雁，禹利君*，徐诗钰，贺军辉，刘仲华，王坤波，刘亚玲

1. 永顺县农业农村局，湖南 永顺 416700；2. 湖南农业大学 茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128；3. 湖南华莱生物科技有限公司，湖南 益阳 413513

“金花”散茶采用冠突散囊菌（俗称“金花”）调控发花，产生众多微生物代谢产物[1]，与黑毛茶、黄茶、白茶等轻发酵茶风味明显不同；与发花前黑毛茶样相比，汤色上增加了红色、橙色，滋味上减少了涩度、增加了甜度。金花越茂盛，茶汤色泽向橙红转变越显著、滋味回甘度越明显[2-3]。“金花”散茶中的可溶性碳水化合物对代谢综合症及肠道菌群有很好的改善作用[4-6]。当前茶叶可溶性碳水化合物的提取测定，习惯沿用“茶样热水浴浸提45 min的蒽酮比色法”[7]，对于金花茂盛的新型发花茶类，该方法是否能实现可溶性碳水化合物的准确测定，未见相关文献报道。本试验以“茶样热水浴浸提45 min”为对照，分别比较了常规沸水浴浸提、超声波辅助浸提、索氏回流浸提等三种方法对“金花”天尖散茶及二级黑毛茶加工的“金花”散茶的浸提效果，为“金花”散茶中可溶性碳水化合物的提取及准确测定提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

湖南农业大学长安茶学教学实习基地2019年春季学生教学实习制备的黑茶天尖原料及“金花”天尖散茶、湖南华莱生物科技有限公司提供的2019年夏季二级黑毛茶及以此原料制备的“金花”散茶。

1.2 主要仪器及试剂

岛津UV-1800紫外可见分光光度计、湘仪TD5S-WS离心机、昆山美美KQ-3200E超声波清洗器、钰杨60 mL微型索氏提取装置、德尔微型粉碎机等。蒽酮、浓硫酸、石油醚、乙醇等试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；茶汤浸泡用水为怡宝纯净水。

1.3 试验方法

1.3.1 可溶性碳水化合物反应体系优选

1.3.2 可溶性碳水化合物浸提方法

（A）常规水浴浸提

（B）超声波辅助浸提

（C）索氏水浴回流浸提

1.4 数据统计分析

测试反应体系3次平行，A、B、C三种浸提方式两次重复，Excel进行数据预处理，SPSS 22.0进行数据分析，可溶性碳水化合物含量以meanSD表示。

2 结果与分析

2.1 蒽酮反应体系优化

2.1.1 蒽酮反应体系对总可溶性碳水化合物含量测定的影响

葡萄糖对照品浓度梯度为 25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL，分别进行0.6%蒽酮硫酸溶液8 mL反应体系a、0.33%蒽酮硫酸溶液4 mL反应体系b。反应体系a葡萄糖对照品吸光度平均值依次为 0.084、0.156、0.317、0.481、0.645和 0.809，一元线性回归方程为 y = 0.0032x - 0.0029（R² = 0.9998），对（A）常规水浴浸提的黑毛茶进行测定，其吸光度平均值依次为0.180、0.178、0.185、0.179、0.187、0.190，在标准曲线范围之内。反应体系b葡萄糖对照品吸光度平均值依次为0.257、0.469、0.906、1.324、1.698和2.171，一元线性回归方程为 y = 0.0084x + 0.0061（R² = 0.9995），对（C）索氏水浴回流浸提的“金花”茶样进行测定，其吸光度平均值依次为1.007、1.010、1.010、0.991、1.012和0.992，在标准曲线范围之内。由此可知，采用0.33%蒽酮硫酸不仅可获得良好的葡萄糖对照品及样品测定，同时还可减少硫酸用量，避免硫酸的潜在危害。

2.1.2 茶汤稀释倍数的影响

黑毛茶、黄茶、白茶等轻发酵茶其总可溶性碳水化合物蒽酮反应经验体系为：3.0 g茶水浴浸提 45 min 后定容至 500 mL，取 1 mL 茶汤进行反应测定[7]。发花茶类因“金花”参与了茶叶代谢产物的深度转化，茶汤滋味甜度明显增加，色泽较黑毛茶、黄茶、白茶等轻发酵茶茶汤色泽明显加深，预实验发现直接取用1 mL茶汤反应其吸光度超出了标准曲线有效范围。配制浓度梯度 25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL 葡萄糖对照品，以反应体系b进行A620 nm吸光度测定，其平均值依次为0.058、0.102、0.201、0.303、0.401 和0.489，一元线性回归方程为 y = 0.0019x + 0.0082（R² = 0.9995）。测试样品茶汤经不同稀释倍数比较发现，天尖、二级黑毛茶及其“金花”散茶其茶汤稀释倍数以5 ～ 10倍为宜。由此可知，茶叶后发酵程度不同导致了茶叶中可溶性碳水化合物含量不同，蒽酮测试反应体系其茶汤稀释倍数也需对应调整，才能得到可靠的测定结果。

2.1.3 活性碳对葡萄糖及茶汤中总可溶性碳水化合物吸附的影响

与超声波辅助浸提、索氏水浴回流浸提方法比较，常规水浴浸提没有添加石油醚去脂、乙醇去蛋白，仅100℃沸水浴45 min，选择加入适量活性碳（料液比1∶100）对茶汤中色素进行吸附，以减少色素物质对总可溶性碳水化合物测定的影响。结果发现：选取150 μg/mL葡萄糖对照品溶液100 mL、加入0.5 g活性炭、120 r/min振荡回旋30 min后进行蒽酮比色法测定，葡萄糖回收率为94.15% ～ 106.44%，说明活性碳对葡萄糖吸附作用不明显；对天尖及二级黑毛茶发花的“金花”散茶浸提液参照葡萄糖对照品处理方式进行活性碳吸附，结果发现可溶性碳水化合物含量下降了65.99% ～ 76.95%。由此推知，茶汤中可溶性碳水化合物与色素物质紧密结合，在去除色素的同时也带走了可溶性糖。可见，活性炭不适合在测试样品茶汤中添加。

2.2 不同浸提方法对天尖及“金花”天尖散茶可溶性碳水化合物含量的影响

以不同浸提方法进行“金花”天尖散茶及天尖原料浸提，提取液稀释5倍，进行反应体系b即4 mL 0.33%蒽酮-硫酸体系比色法测定。表1测定结果可知，三种浸提方式显示经发花后可溶性碳水化合物含量均极显著增加；对天尖及“金花”天尖散茶而言，超声波辅助浸提与常规水浴浸提效率相当；索氏水浴回流浸提时间长达2.5 h，其可溶性碳水化合物含量也最高，分别达到6.45%和9.96%，但每批次处理样品少。综合分析可知，若样品少，为实现可溶性碳水化合物含量精准测定，索氏水浴回流浸提为最优方法；若样品量大，为比较实验处理导致的可溶性碳水化合物含量差异，常规水浴浸提、超声辅助浸提为首选，但超声辅助浸提每批次处理的样品量更大，能耗更低。

2.3 不同浸提方法对二级黑毛茶及其“金花”散茶可溶性碳水化合物含量影响

以不同浸提方法进行二级黑毛茶及发花散茶茶样浸提，提取液稀释10倍，进行反应体系b测定。表2测定结果可知：超声波辅助浸提、索氏水浴回流浸提更加有助于发花散茶中可溶性碳水化合物浸提，与其二级黑毛茶比较，差异均达到了极显著水平；常规水浴浸提条件下其发花前后可溶性碳水化合物含量没有显著差异。由此可知，对于原料较粗老的茶叶及其加工出的“金花”黑茶产品，需要较长时间的索氏回流或超声波辅助高效提取，才能获得较高的可溶性碳水化合物浸提率。

表1 天尖及“金花”天尖散茶可溶性碳水化合物含量比较 （%）Table 1 Comparison of soluble carbohydrate extraction contents of Tianjian and “Jinhua” Tianjian loose tea （%）

表2 二级黑毛茶及其“金花”散茶中可溶性碳水化合物含量比较 （%）Table 2 Comparison of soluble carbohydrate extraction contents of 2th grade raw dark tea and its “Jinhua” loose tea（%）

3 讨论

蒽酮-硫酸比色法是一种测定样品中单糖、双糖和多糖含量的常用方法，样品中的糖类在浓硫酸作用下，脱水生成糠醛及其衍生物与蒽酮发生反应呈蓝绿色，颜色深浅不一，糖的含量也不相同；常规反应体系以葡萄糖为对照品，1 mL 茶汤与 8 mL 0.6% 蒽酮 -硫酸溶液沸水浴8 min进行比色测定，可实现茶叶中可溶性碳水化合物含量快速测定。为探究蒽酮反应体系的浓度及适当用量，王黎明等对纯化的茶多糖进行研究发现，4 mL 0.05%的蒽酮-硫酸与1 mL纯化的多糖溶液反应，可获得理想测定结果[8]；傅博强等对茶叶中多糖含量测定采用吸取1 mL茶汤与4 mL 0.33%蒽酮-硫酸溶液沸水浴7 min进行反应，取得了理想测试结果[8]。由此可知，减少蒽酮硫酸用量及浓度，对茶叶中可溶性糖测定是可行的。然而，可溶性糖在茶叶的配比组成存在差异，茶叶样品是以葡萄糖为基本组成，但茶花等样品是以半乳糖为基本组成。为此，以葡萄糖还是半乳糖作为检测对照品，张海星等研究发现需根据原料情况选择相应分析测试体系[10]；本试验通过将常规反应体系a与减少蒽酮-硫酸浓度及用量的反应体系b进行对比研究发现，采用反应体系b对“金花”散茶及其发花原料可获得良好测定结果，同时也减少了浓硫酸的用量。

黑茶原料经冠突散囊菌发花产生了复杂的生物化学反应及代谢产物，发花后的黑茶新增了油脂类、色素、可溶性碳水化合物等多种风味物质[1]。已有研究报道，为减少油脂对玫瑰叶中可溶性多糖含量测定结果的干扰，采用石油醚回流脱脂[11]；王雪媛等研究发现，肉苁蓉油脂、蛋白含量极高，加入95%乙醇水浴回流2 h可减少对多糖含量测定结果的干扰[12]；茶叶经冠突散囊菌发花后产生了较多的色素及油脂类物质[1]，在刘雁等感官审评结果也得到了明显体现[2]。从本试验测定结果（表1、表2）分析可知，热水浴浸提后茶汤中色素、油脂、蛋白没有对测定结果产生干扰；活性碳对葡萄糖对照品吸附可以忽略不计，但加到茶汤中脱色会造成茶汤中糖类物质大量被吸附，因此活性碳不宜添加到茶汤中。超声波辅助浸提、索氏水浴回流浸提均采用石油醚脱脂、乙醇去蛋白，80%乙醇浸提离心弃上清。从测定结果（表1、表2）来看，与常规水浴浸提比较，超声波辅助浸提量略有升高、索氏水浴回流浸提量明显升高。因此，若仅是对大批量样品进行可溶性碳水化合物含量测定，为减少工作时间、节约能耗，超声波辅助浸提为首选；若需准确测定“金花”黑茶中可溶性碳水化合物含量，索氏水浴回流浸提尽管历时长、操作繁琐，不便于实现大批量样品浸提，但可获得可溶性碳水化合物含量的充分浸提以达到准确测定。