应用TLC-CMS技术检测核桃青皮中二芳基庚烷类化合物

杨卫民，杜京旗，王子奇

（吕梁学院吕梁林果植物化学省市共建山西省重点实验室培育基地，山西省特色植物功能成分工程研究中心，山西吕梁 033001）

核桃（Juglans regia L.）又称胡桃，属于胡桃科核桃属落叶乔木。核桃青皮为核桃果皮部分，又称“青龙衣”，含有多种化合物，如醌类、二芳基庚烷类、多酚类、生物碱类、萜类等化合物，具有止痛止痢、祛风疗癣、清热解毒等功效。核桃青皮提取物中醌类、二芳基庚烷类、生物碱类等化合物还具有抗肿瘤的活性，成为了现阶段核桃青皮研究的重点方向。

二芳基庚烷类化合物结构式见图1。

核桃青皮中的二芳基庚烷类化合物是一种含有1,7-二芳基庚烷母核的天然化合物的总称。二芳基庚烷类化合物可根据其结构划分为线性二芳基庚烷、内环状二芳基庚烷、大环二芳基庚烷3类，大环二芳基庚烷是比较常见的类型（图1）。具有广泛的药理活性，是核桃青皮中主要的抗肿瘤活性成分，且化学结构独特，具有非常高的研究价值，主要存在于许多植物的根部、茎部、表皮、花和果皮等部位。

图1 二芳基庚烷类化合物结构式

近年来，国内外学者从核桃青皮中提取分离出其他大量化学物质，具有生物活性物质近50种。研究人员采用了BSLB法初步筛选了核桃青皮抗肿瘤活性成分，发现其乙酸乙酯提取物具有较明显的抗肿瘤活性[1]。周媛媛等人[2]对核桃青皮中的二芳基庚烷类化合物进行了深度研究，并且进行了结构鉴定，探索出了5个二芳基庚烷类化合物。还有研究人员发现核桃青皮乙醇提取物中有4个强抗癌活性的环状二芳基庚烷类化合物[3-7]。试验以核桃青皮为原料，以75%甲醇为提取剂，经微波超声波组合萃取仪辅助处理，用薄层层析分离纯化获得二芳基庚烷类化合物，应用Plate ExpressTM技术对其进行了检测与表征。该技术可直接从TLC薄层板上获取质谱图，其优点是不经过样品前处理，可快速从复杂混合物中获得目标物分子质量信息，并对其进行检测和鉴定。

1 材料与方法

1.1 试验器材

材料：胡桃青皮（吕梁当地）。

试剂：甲醇、乙酸乙酯、苯、无水乙醇均为分析纯；色谱甲醇；薄层硅胶板色谱分析板。

仪器：ALB-224型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司产品；XH-300B型微波-超声波组合合成/萃取仪，北京祥鹄科技发展有限公司产品；KH-3000Plus型薄层色谱仪，上海科哲生化科技有限公司产品；Expressions型质谱仪、Plate Express TLC-质谱接口，美国Advion公司产品；Tensor-11型傅里叶红外光谱仪，德国布鲁克公司产品。

1.2 试验方法与步骤

1.2.1 核桃青皮中二芳基庚烷类化合物的提取

按料液比（1∶30，M/V）加入75%的甲醇，用微波超声波萃取仪分为3个阶段进行提取，每阶段均为10 min，共30 min。在超声波恒定的条件下，设置温度分别为40，45，50℃；微波功率分别为100，200，300 MHz；超声功率分别为850，900，800 W；模式15∶10，电机转速为900 r/min。

甲醇提取液于转速4 000r/min离心3次，每次10 min，合并上清液，收集滤渣。滤渣中加入乙酸乙酯，恒温振荡5 h，减压过滤3次，获乙酸乙酯相。在78℃下浓缩至膏状，甲醇定容至25 mL。

1.2.2 薄层色谱分离纯化

用微量进样器吸取25μL的核桃青皮二芳基庚烷样液，置于全自动点样机上，设置点样参数（点样边距10 mm，点样间距10 mm，点样宽度8 mm，点样数目5，点样量为3μL，点样速度2 s/μL），在10×10硅胶板上进行点样，共点样15μL。

以苯∶乙酸乙酯（11∶1，V/V)为展开剂，将已点样硅胶板放入展开剂液面高2~3 mm的层析缸内，待到展开剂前沿距离硅胶板顶端约1 cm处时，取出晾干。将硅胶板放入薄层色谱成像系统，于波长365 nm处的紫外光灯下观察标记。

1.2.3 质谱检测

用色谱甲醇和超纯水作为流动相。使仪器和软件处于工作状态，将待测品薄层板置于TLC-质谱接口上，使激光对准圈出的色谱斑点中心处。用软件操作进行取样，点开谱图界面对谱图进行分析并保存。

1.2.4 红外光谱检测

将硅胶板上已标记的色谱斑点进行编号，抠取色谱斑点，甲醇溶解，过滤。

红外光谱仪测量每一个样品之前，都需要测量单通道背景光谱，然后将样品用毛细管点样至光学台的金刚石上，再进行单通道样品光谱的测量。每一个样品测量后，都需要进行谱图处理。例如，进行气氛补偿，可消除CO2、H2O的干扰，然后将检测出来的光谱转换成倒峰，选择单峰检索标出每一个特征峰，保存并进行分析。与文献数据进行比对分析，记录高度吻合的条带。

1.2.5 旋光度和熔点检测

设置自动旋光仪至模式2。在参数（长度1.0，浓度1.000，复测次数3次，波长1）下测定旋光度，计算平均值。模式1，在参数（长度1.0，比旋度设定为测量平均值，复测次数3次，波长1）下测定比旋度，取平均值。

待提取液完全结晶后用毛细管吸取样液中，高度2~3 mm。然后开启电源开关进行熔点测定。

2 结果与分析

2.1 核桃青皮中二芳基庚烷的提取率

核桃青皮中二芳基庚烷类化合物的提取率见表1。

表1 核桃青皮中二芳基庚烷类化合物的提取率

核桃青皮中二芳基庚烷的提取率：

平均提取率=[(197.0-196.9)/7.2+(197.1-196.9)/7.2+(197.1-196.9)/7.2]×100%÷3=1.6%.

2.2 薄层色谱分离纯化与分析

核桃青皮乙酸乙酯相TLC成像图见图2。

图2 核桃青皮乙酸乙酯相TLC成像图

由图2可知，核桃青皮乙酸乙酯相在苯∶乙酸乙酯（11∶1，V/V）下，于波长365 nm处紫外光观察，展开效果良好，出现了5个色谱斑点，且图像清晰，色谱斑点之间应保持适当的间距，分离效果良好。5个色谱斑点自上而下分别用字母A，B，C，D，E标记，便于进行红外和质谱检测与分析。

2.3 质谱检测与分析

判定该二芳基庚烷类化合物的分子离子峰，根据文献数据将讨论范围划定到358 m/z左右。分子离子峰需要满足几个必要的条件，即该范围谱图内的最高质量（m/z较大者）的离子。

通过查阅文献[2，8]，了解到了二芳基庚烷类化合物的相关质谱数据。EI-MS给出358[M]+，表明相对分子质量为358。

色谱斑点A质谱图见图3。

图3 色谱斑点A质谱图

由图3可知，色谱斑点A在358 m/z左右的质荷比最高的分子离子峰为361.0，但是二芳基庚烷类化合物不含有氮原子，分子离子峰应当为偶数，361为奇数，所以该结果不成立。

色谱斑点B质谱图见图4。

图4 色谱斑点B质谱图

由图4可知，362.0 m/z为该范围内最高质量的离子峰。其分子离子峰满足氮规则，二芳基庚烷类化合物中不包含氮原子，分子离子峰质量数应为偶数。最后需要判断其与相邻碎片离子（m/z较小者）之间的关系是否合理，分子离子峰与较小的碎片离子峰相减能否产生合理的碎片丢失（Δm），Δm=362.0-360.7≈1，表示该化合物在电子的轰击下打掉了一个H，为合理丢失。362.0 m/z的离子峰符合这些条件。

色谱斑点C质谱图见图5。

图5 色谱斑点C质谱图

362.0 m/z与文献中报道的数据358 m/z近似，所以色谱斑点B基本符合二芳基庚烷类化合物的质谱特征。

由图5可知，C条带在358 m/z左右的质荷比最高的分子离子峰为360.7，分子离子峰与较小的碎片离子峰相减能否产生合理的碎片丢失，Δm=360-353.3≈7，属于不合理的碎片丢失。

色谱斑点D质谱图见图6。

由图6可知，D条带样品最高分子离子峰为359.6，分子离子峰与较小的碎片离子峰相减能否产生合理的碎片丢失，Δm=359.6-349.2≈10，属于不合理的碎片丢失。

图6 色谱斑点D质谱图

色谱斑点E质谱图见图7。

图7 色谱斑点E质谱图

由图7可知，E条带样品在358 m/z左右并未出现明显的离子峰，离子峰大多出现在了370 m/z以上的位置。与文献所记载的数据有很大的偏差，不符合二芳基庚烷类化合物的特征。

2.4 红外光谱检测与分析

依次将色谱斑点A，B，C，D，E用色谱甲醇定容的溶液分别进行红外光谱分析。根据文献记载，二芳基庚烷类化合物红外光谱多在3 300~3 500 cm-1，1 269 cm-1处有羟基的特征吸收峰，在2 931 cm-1和2 858 cm-1处有饱和CH伸缩振动的特征吸收峰，在1 708 cm-1处有羰基特征吸收峰，在1 600 cm-1处、1 500~1 550 cm-1有苯环的特征吸收峰，在1 070 cm-1处有醚键的特征吸收峰[8]。

色谱斑点A红外图谱见图8。

由图8可知，A条带在3 000~3 500 cm-1有明显的羟基峰，但是其他的特征峰与二芳基庚烷类化合物的红外光谱特征峰吻合度并不高。

色谱斑点B红外图谱见图9。

图8 色谱斑点A红外图谱

图9 色谱斑点B红外图谱

由图9可知，色谱斑点B的红外图谱与文献记载最为吻合。斑点B在3 382，1 289 cm-1处出现羟基的特征吸收峰；在2 955，2 925，2 856 cm-1处有饱和CH伸缩振动的特征吸收峰；在1 730 cm-1处有羰基特征吸收峰；在1 590 cm-1处有苯环的特征吸收峰；在1 073 cm-1处有醚键的特征吸收峰。故判定色谱斑点B可能为二芳基庚烷类化合物。

色谱斑点C红外图谱见图10。

图10 色谱斑点C红外图谱

由图10可知，C条带在3 200~3 500 cm-1处有羟基峰出现，但不具备二芳基庚烷类化合物的其他特征峰。

色谱斑点D红外图谱见图11，色谱斑点E红外图谱见图12。

由图11和图12可知，D与E条带的红外图谱总体来说很相似，二者图谱与二芳基庚烷类化合物的特征吸收峰相差甚远，吻合度不高。

2.5 二芳基庚烷的旋光度、熔点

使用自动旋光仪对二号条带进行旋光度和比旋度的测定。

核桃青皮中二芳基庚烷样品的旋光度见表2。

图11 色谱斑点D红外图谱

图12 色谱斑点E红外图谱

表2 核桃青皮中二芳基庚烷样品的旋光度

将3次试验所得出的比旋度、旋光度数据取平均值。

平均比旋度=55.365+55.670+56.228/3≈55.754

平均旋光度=0.513+0.581+0.524/3≈0.539

将测量旋光度和比旋光度后的样品进行结晶，放置入熔点仪中进行熔点的测定，熔点仪结果显示为183℃。则可判定2号条带的二芳基庚烷类化合物熔点为183℃。

3 结论

甲醇-水（3∶1）作提取剂，多级萃取结合微波超声波组合辅助处理从核桃青皮中获得乙酸乙酯提取液，提取率为1.6%。

核桃青皮样液在优化试验条件下，以苯∶乙酸乙酯（11∶1，V/V）为最佳展开剂，展开效果良好；GF254硅胶板在365 nm下，于GoodSsee-20E薄层成像系统中观察效果良好，5个色谱斑点清晰。

在展开的5个色谱斑点中，色谱斑点B的分子质量（362.0 m/z）与相关文献（358 m/z）相近，与相邻碎片离子之间的关系合理Δm=362.0-360.7≈1）；在3 382，1 289 cm-1处出现羟基的特征吸收峰，2 955，2 925，2 856 cm-1处有饱和CH伸缩振动的特征吸收峰，1 730 cm-1处有羰基特征吸收峰，1 590 cm-1处有苯环的特征吸收峰，1 073 cm-1处有醚键的特征吸收峰；比旋度、旋光度、熔点分别为55.754，0.539，183℃。色谱斑点B与相关文献报道基本相一致，可能是二芳基庚烷类化合物[9-15]。

超声波微波组合萃取仪是集超声波、微波、温度等于一体的集合处理系统，对各个创新要素和创新内容进行选择、集成和优化，形成优势互补的有机整体的动态创新过程。采用了控制一定的温度，优点是条件温和、易于控制、提取率高、处理时间短，可提高提取率。

TLC分离、纯化技术能适应不同物化特性的溶剂体系和多样性的操作条件，具有较强的适应性，为从复杂的天然产物粗制品中提取不同特性（如不同极性）的有效成分提供了有利条件。其中，选择展开剂不但要考虑到对所需成分有良好的溶解性，还要使各个成分之间分开，消除拖尾现象，选择合适的展开剂对薄层色谱分离纯化来讲十分重要。

在红外检测时，有时候会出现样品的特征峰与甲醇的特征峰相似的现象，初步推断出现该问题的原因是甲醇添加过多，或可能检测的物质含量过小，导致其特征峰被甲醇特征峰所掩盖[16-20]。

质谱检测时，存在其他多个碎片离子峰或者基峰，推测原因有3个：其一选择的离子源不合适，导致打出的碎片杂多；其二在电轰击过程中，产生了成倍的碎片离子峰；其三分离纯化程度不够，进入质谱的样液尚存在杂质。

总之，TLC-CMS-IR联用在生物活性物质分离纯化中具有操作简便、容易掌握、回收率高、重现性好、分离效率高、分离量较大等特点[21-23]，有望在标准品的制备、天然产物化学成分研究及新药筛选、评价、分析或质控需求等领域得到更为广泛的应用。