miR-25通过靶向BCL2L11在脓毒症致AKI细胞模型中发挥保护性作用

吴 斌,王美堂

脓毒症是由感染因素引起的最致命的全身性炎症综合征，可引起休克、多器官功能障碍综合征，甚至死亡[1]。急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）是脓毒症最严重的并发症之一[2]。如果能在AKI早期进行干预，可显著降低脓毒症患者的病死率[3]。因此，研究脓毒症致AKI的病理生理改变机制，寻求有效治疗手段是一个亟待研究的课题。

miRNAs是一类非编码RNA，通过抑制翻译或降解mRNA来负调控基因表达[4]。目前关于miRNAs在脓毒症肾损伤中的研究较少[5]。已有研究发现miR-204可通过抑制核因子 κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）途径活化，抑制脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的RMCs细胞损伤[6]，miR-107则可通过诱导TNF-α分泌，加重肾小管上皮细胞损伤[7]。上述研究提示miRNAs在脓毒症致AKI的发生、发展中起着重要调节作用。先前研究发现miR-25在脓毒症患者体内表达下调[8]。Yao等[9]发现miR-25通过靶向PTEN抑制脓毒症诱导的心肌细胞凋亡。然而，miR-25是否脓毒症致AKI的发病机制尚不清楚。因此，本研究通过建立LPS诱导肾小管上皮细胞（HK-2）损伤的细胞模型体外模拟AKI研究miR-25的保护性作用，旨在为临床治疗脓毒症致AKI提供新的治疗思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 HK-2细胞购自上海富衡生物科技有限公司。胎牛血清、青霉素-链霉素、Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、Lipofectamine 3000转染试剂及TaqMan-MicroRNA逆转录试剂盒均购自美国Invitrogen公司。LPS购自美国Sigma-Aldrich公司。MiR-25模拟物（miR-25 mimic）、miR-25抑制剂（miR-25 inhibitor）和阴性对照物（negativecontrol,NC）购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司，过表达BCL2L11质粒（pc-BCL2L11）及空载质粒（vector）均由上海生工生物工程有限公司负责构建。细胞计数试剂盒（Cell counting kit-8,CCK-8）购自日本Dojindo公司。RNA提取试剂、逆转录试剂盒及SYBR荧光定量试剂盒均购自日本Takara公司。荧光素酶报告基因分析系统购自美国Promega公司。蛋白强裂解液、发光显影液、抗体稀释液购自上海生工生物工程有限公司。一抗购自美国Abcam公司，包括：B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,BCL-2，ab32124,1:1000）、BCL-2相 关 的X基 因 （BCL2-Associated X,Bax,ab53154,1∶1000）、 剪切的半胱氨酸蛋白酶-3（cleaved Caspase-3,ab32042,1∶1000）、cleaved Caspase-9（ab2324,1:1000）和 β-肌动蛋白（β-actin,ab8226,1:2000）。BCL-2样蛋白11（BCL-2-likeprotein 11,BCL2L11,#374358,1∶1000）抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.2 细胞培育与处理 使用含10%胎牛血清、1%青霉素（100 U/ml）和链霉素（100μg/ml）的DMEM培养基，将细胞置于37°C，相对湿度，含5%CO2的培养箱进中行细胞培养。 用不同浓度（0、1、2、4、6、8和10μg/ml）LPS处理HK-2细胞12 h摸索LPS诱导AKI细胞模型的浓度。

1.3 细胞转染 根据说明书，使用Lipofectamine 3000试剂分别将miR-25 mimic、miR-25 inhibitor、NC、pc-BCL2L11及Vector转染至HK-2细胞中。转染72 h后，收集细胞进行后续实验。1.4 CCK-8检测细胞活性变化 当HK-2细胞（104个细胞/孔）分别完成pc-BCL2L11、miR-25 mimic、miR-25 inhibitor转染和LPS刺激时，利用CCK-8评估细胞活力。将10μl CCK-8加入至细胞细胞液中并继续培养3 h，后用分光光度计测量450 nm处的吸光度。

1.5 实时定量PCR（qRT PCR）检测细胞mRNA表达水平 根据试剂说明，使用Trizol试剂提取HK-2细胞中的总RNA。使用分光光度计定量mRNA浓度后，将mRNA逆转录合成cDNA，后用SYBR试剂盒进行PCR扩增检测荧光水平，使用β-actin作为内参基因，2-ΔΔCT方法计算进行相对表达量的计算。采用TaqMan-MicroRNA逆转录试剂盒和TaqManmiRNA分析对miRNA表达进行定量，U6被用作内参基因进行计算。引物序列见表1。

1.6 荧光素酶报告基因分析 根据说明书指导，将BCL2L11基因的野生型（wild-type,wt）和突变型（mutant-type,mut）的3'UTR片段克隆到pGL3荧光素酶报告载体中。将HK-2细胞（2×104细胞/ml）接种于6孔培养板上，次日用Lipofectamine（Invitrogen）将报告质粒和miR-25 mimic共转染至细胞。采用双荧光素酶检测试剂盒检测转染72 h后的荧光素酶活性。

1.7 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测炎症因子水平将处理后的HK-2细胞上清液进行定量，根据说明书指导检测TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

1.8 蛋白印迹法（Western blot）检测细胞蛋白表达水平 收集HK-2细胞沉淀，并用RIPA蛋白裂解液（已添加蛋白酶抑制剂）进行溶解。将提取的蛋白质通过SDS-PAGE凝胶电泳进行分离，后转移至PVDF膜上。室温下，在5%脱脂牛奶中封闭1 h后，将膜与一抗在4℃下培养过夜。次日洗涤后，用与HRP结合的相应二抗在室温下孵育膜2 h，最后用增强化学发光溶液在成像系统中进行荧光定量。

1.9 统计学方法 所有实验至少进行3次，数据用平均值（mean）±标准差（SD）表示。应用SPSS 22.0软件（美国,SPSS）进行统计分析，两组或多组间的比较采用Student t检验或单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 引物序列

2 结果

2.1 miR-25抑制LPS诱导的HK-2细胞凋亡和增殖阻滞 用0、1、2、4、6、8和10μg/ml LPS处理HK-2细胞可使其细胞活力水平在LPS处理下同样以剂量依赖性方式降低（P＜0.05）；不同浓度LPS处理HK-2细胞还可显著诱导细胞表达miR-25呈剂量依赖性降低（P＜0.05）。见表2。

细胞转染miR-25 mimic后，细胞表达miR-25水平均明显升高（P＜0.05），相反转染miR-25 inhibitor后，miR-25水平均显著下降（P＜0.05），从而验证了miR-25 mimic及inhibitor的有效性；与LPS诱导损伤的细胞相比，过表达miR-25的HK-2细胞经LPS处理后，细胞活性显著增加，而转染miR-25 inhibitor的细胞呈相反表现。见表3。

Western blot结果（表4）示，与LPS诱导损伤组细胞相比，过表达miR-25的细胞表达促凋亡蛋白Bax、cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-3均显著降低（P＜0.05），而抑制凋亡蛋白BCL-2表达显著增高（P＜0.05），转录miR-25 inhibitor则有相反的变化（P＜0.05）。

2.2 miR-25减轻LPS对HK-2细胞的炎症损伤HK-2细胞过表达miR-25可逆转LPS刺激HK-2细胞后IL-6、IL-1β 和TNF-α 浓度的增加（P＜0.05），而当细胞低表达miR-25时，则具有相反的效果（P＜0.05）。 见表5。

2.3 过表达BCL2L11逆转miR-25介导的对LPS诱导HK-2细胞炎症和凋亡的抑制作用 使用TargetScan软件进行预测，发现BCL2L11的3'UTR序列与miR-25互补（图1）。为验证此观点，检测荧光素酶活性，发现当细胞转染miR-25模拟物可显著降低野生型（Wt）BCL2L11 3'UTR的荧光素酶活性（P＜0.05），而突变型（Mut）3'UTR的荧光素酶活性（P＞0.05），见表6。另外，当细胞过表达或者低表达miR-25时，BCL211L蛋白水平会随之降低或者升高（P＜0.05），见表7。通过将BCL2L11过表达质粒和miR-25 mimic转染到这些细胞中，Western blot结果（表8）示细胞转染BCL2L11后该蛋白表达显著增加（P＜0.05），提示质粒有效性。细胞过表达BCL2L11可显著逆转miR-25对LPS诱导的HK-2细胞凋亡和炎症的影响（P＜0.05）。见表9。

图1 使用TargetScan预测miR-25和BCL2L11之间的结合位点

3 讨论

本研究经细胞实验发现，miR-25过表达可靶向BCL2L11，降低其表达水平，并可抑制凋亡和炎症反应的发生，提示miR-25可能参与了脓毒症致AKI的进展。

表2 不同LPS处理浓度对K-2细胞活性及mi R-25表达水平的影响（? s）

表2 不同LPS处理浓度对K-2细胞活性及mi R-25表达水平的影响（? s）

注：以不同浓度（0、1、2、4、6、8和10 μg/ml）LPS处理HK-2细胞12 h。与对照组（0 μg/ml）比较，①P ＜ 0.05

组别 0 1 2 4 6 8 10细胞活性（%） 99.67±5.01 77.00±3.01 67.70±2.46 60.87±2.50 54.67±3.07 42.63±4.26 miR-25表达水平 1.12±0.11 0.92±0.06 0.77±0.06 0.64±0.06 0.51±0.07 0.34±0.10 0.16±0.06

表3 miR-25与LPS共同处理对HK-2细胞活性的影响(? s )

表3 miR-25与LPS共同处理对HK-2细胞活性的影响(? s )

注：与对照组（Control）或NC组比较,①P ＜ 0.05

组别 Control NC mimic inhibitor Control NC mimic inhibitor未处理 LPS（8 μg/ml）miR-25水平 0.99±0.06 1.01±0.06 0.36±0.08 0.73±0.07 0.70±0.10 3.86±0.55 0.19±0.08 细胞活性（%） 98.17±6.17 96.67±4.83 99.43±4.51 99.27±5.18 53.30±3.63 50.60±1.97 73.90±5.82 26.27±4.06

表4 miR-25与LPS共同处理对HK-2细胞表达蛋白的影响(? s)

表4 miR-25与LPS共同处理对HK-2细胞表达蛋白的影响(? s)

注：与Control组比较，①P ＜ 0.05；与LPS+NC组比较，②P ＜ 0.05

组别 Control LPS LPS+NC LPS+mimic LPS+inhibitor 0.17±0.04 Bax/β-actin 0.16±0.05 0.93±0.07 1.01±0.10 0.23±0.07 1.08±0.16 Cleaved Caspase-3/β-actin 0.19±0.05 1.06±0.15 1.08±0.15 0.17±0.12 1.01±0.19 Cleaved Caspase-0/β-actin 0.20±0.10 0.96±0.13 0.97±0.13 0.23±0.10 0.98±0.26

表5 各组细胞炎症因子水平比较(? s )

表5 各组细胞炎症因子水平比较(? s )

注：与Control组比较，①P ＜ 0.05；与LPS+NC组比较，②P ＜ 0.05

组别 IL-6 (pg/ml) IL-1β( pg/ml) TNF-α(pg/ml) 475.00±35.76 893.67±85.62 LPS+NC 611.67±22.55 465.00±61.88 905.67±74.84 LPS+miR-25 mimic 271.00±38.74 145.67±14.01 303.33±26.58 LPS+miR-25 inhibitor 813.00±35.59 697.67±34.56 1110.67±95.51

表6 荧光素酶报告基因验证结合靶点(? s )

表6 荧光素酶报告基因验证结合靶点(? s )

注：与NC组比较，①P ＜ 0.05

组别 NC mimic NC mimic荧光素酶活性 1.05±0.06 1.00±0.07 Wt-BCL2L11 Mut- BCL2L11

表7 miR-25对细胞表达 BCL2L11蛋白水平的影响(? s)

表7 miR-25对细胞表达 BCL2L11蛋白水平的影响(? s)

注：与Control组比较，①P ＜ 0.05，与LPS+NC组比较，②P ＜ 0.05

组别 Control LPS LPS+NC LPS+mimic LPS+inhibitor BCL2L11蛋白水平 0.17±0.06 1.09±0.12 0.38±0.06 1.16±0.06

表9 miR-25与BCL2L11共表达对HK-2细胞活性、炎症因子释放及蛋白表达水平的作用(? s）

表9 miR-25与BCL2L11共表达对HK-2细胞活性、炎症因子释放及蛋白表达水平的作用(? s）

注：与LPS+NC+Vector组比较,④P ＜ 0.05；与LPS+miR-25 mimic+Vector组比较,⑤P ＜ 0.05

组别 LPS+NC+Vector LPS+NC+pc-BCL2L11 LPS+mimic+Vector LPS+mimic+pc-BCL2L11

表8 BCL2L 11质粒转染有效性验证(? s)

表8 BCL2L 11质粒转染有效性验证(? s)

注：与对照组比较,①P ＜ 0.05

组别 Control Vector pc-BCL2L11 BCL2L11表达水平 0.34±0.09 0.33±0.08

凋亡是一种程序性细胞死亡过程，参与了败血症致AKI的发生[10]。在本研究中，发现当HK-2细胞miR-25过表达后，LPS刺激细胞表达凋亡相关蛋白Bax、Caspase 3和Caspase 9减少，而BCL-2增加。因此，本研究推测miR-25过表达可能通过抑制内源性凋亡途径，对脓毒症诱导的AKI起到保护作用。促炎症反应在脓毒症致AKI的发病机制中占重要地位。本研究发现LPS刺激HK-2细胞可使其表达促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平显著升高，而细胞过表达miR-25时，可发挥其抗炎特性，降低上述4种细胞因子的水平。

越来越多的研究通过miRNAs可靶向调节目的基因发挥[11]。本研究证明miR-25可负调控BCL2L11表达基于BCL2L11抑制的研究发现，过表达BCL2L11可逆转miR-25过表达对LPS诱导HK-2损伤的影响，提示miR-25对LPS诱导HK-2细胞损伤的影响是通过调节BCL2L11实现的。已知BCL2L11属于BH3家族，是细胞凋亡信号通路中的关键调节因子[12]。既往尚无研究报道BCL2L11与脓毒症致AKI的关系，因此本研究将为未来进一步探讨BCL2L11的作用提供理论基础。

综上所述，本研究发现，在LPS诱导HK-2损伤时，miR-25呈低表达水平。过表达miR-25可通过靶向抑制BCL2L11，减少炎症因子产生和抑制凋亡反应的发生，从而减轻LPS诱导的HK-2细胞损伤。