Lnc01287/miR-4500通过TGF-β/Smad通路影响特发性肺纤维化进展的相关机制

薛成 林益华 史永红

厦门大学附属第一医院呼吸与危重症医学科361000

特发性肺纤维化是呼吸内科的疑难病,可由微生物感染、吸入粉尘及颗粒、结缔组织病等引起。患者可出现渐进性的呼吸困难,最终导致死亡,对患者的工作和生活造成极大危害。它的病理基础为各种因素导致肺泡上皮的慢性损伤,造成肺瘢痕成纤维细胞的大量增生,合成大量的胶原纤维,最终导致肺结构的重塑和肺纤维化的产生[1]。因此,对肺瘢痕成纤维细胞过度增生的机制研究已成为特发性肺纤维化研究的热点。

LncRNA 为一类不编码蛋白质的长链RNA,通常通过miRNA 及信号通路对细胞的生物学行为起 重 要 的 调 控 作 用[2]。 转 化 生 长 因 子 β(transforming growth factor-β,TGF-β)/Smad通路是与纤维化密切相关的一条信号通路,与心、肺、肝、肾等器官的纤维化密切相关[3]。Lnc RNA很可能也通过调控miRNA 进而影响TGF-β/Smad通路的活化,最终促进人肺瘢痕成纤维细胞的增殖。本研究首先通过原代培养人肺成纤维细胞与人肺瘢痕成纤维细胞,研究Lnc01287、miR-4500、TGF-β/Smad通路在2种细胞中的表达;再通过基因相互作用预测网站与双荧光素酶报告基因实验,研究Lnc01287、miR-4500、TGF-β/Smad 通路间的相互作用关系;最后通过基因过表达与抑制技术,研 究Lnc01287/miR-4500 通 过TGF-β/Smad通路对人肺瘢痕成纤维细胞增殖的调控,以期为发现治疗特发性肺纤维化的靶点、减缓此病的进展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验标本 本研究获得了厦门大学附属第一医院伦理委员会的批准 (批号2020-02),实验标本取自健康者与稳定期的特发性肺纤维化患者。健康者为经我院体检,没有任何基础病,且自愿提供标本的志愿者。稳定期的特发性肺纤维化患者为在我科就诊,高分辨率CT 提示肺间质纤维化,生命体征平稳,且排除了结缔组织病、粉尘吸入、药物引起等明确的病因。所有入组人员均签署了知情同意书,最终入组4名健康者与4例稳定期的特发性肺纤维化患者。气管镜下用活检钳分别夹取对照组和实验组的气道黏膜组织。

1.2 实验细胞 将上述对照组和实验组的气道黏膜组织清洗干净后,分别加入含20%特级胎牛血清的高糖DMEM 培养基,进行原代培养,由于成纤维细胞为优势细胞,随着培养时间的延长,视野中只剩下人肺成纤维细胞与人肺瘢痕成纤维细胞,待细胞呈90%融合后,进行传代,取3～6代的细胞进行后续的实验。

1.3 实验材料与仪器 高糖DMEM 培养基、特级胎牛血清、胰酶购自美国Hyclone公司,Trizol购自美国Life Technologies 公司,Lnc01287、miR-4500引物购自生工生物工程 (上海)股份有限公司,逆转录与实时荧光定量PCR 试剂盒购自日本Takara公司,人TGF-β 酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司,细胞裂解液与BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司,GAPDH、Smad3抗体购自英国Abcam公司,PVDF 膜购自北京索莱宝科技有限公司,ECL发光液购自美国Millipore公司,Lnc01287、TGFBR1 wt及mut荧光素酶质粒与Lnc01287、miR-4500、TGFBR1高低表达质粒购自上海吉玛制药技术有限公司,细胞转染试剂盒购自美国Thermo Fisher公司,双荧光素酶报告基因实验试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司,MTT 细胞增殖检测试剂盒购自凯基生物科技发展有限公司。细胞培养箱购自新加坡ESCO 公司,生物显微镜购自日本Olympus 公司,逆转录与实时荧光定量PCR 仪购自美国Applied Biosystems公司,酶标仪购自雷杜生命科学股份有限公司,条带曝光成像仪购自美国General Electric公司。

1.4 细胞转染 将人肺瘢痕成纤维细胞按1.5×105/皿的密度接种在6 cm 培养皿中,待细胞呈50%左右融合后,根据细胞转染试剂盒的说明书,加入转染试剂和质粒,分为9 组。第1 组为对照组,第2 组 为Lnc01287 mimic 组,第3 组 为miR-4500 inhibitor组,第4 组为TGFBR1 mimic组,第5组为si-Lnc01287组,第6组为miR-4500 mimic组,第7 组为si-TGFBR1 组,第8 组为Lnc01287 mimic+miR-4500 mimic组,第9 组为miR-4500 inhibitor+si-TGFBR1组。37 ℃细胞培养箱培养8 h后,换完全培养基继续培养,直至细胞长满,生物显微镜下观察细胞的形态,有代表性的图片进行拍照。

1.5 实时定量PCR 实验 将3～6代的人肺成纤维细胞与人肺瘢痕成纤维细胞以2×105/孔的密度接种在6孔板中,培养48 h后,加入Trizol,裂解细胞,再分别加入氯仿、异丙醇,提取RNA,用乙醇清洗RNA,将提纯的RNA 溶解在DEPC 水中,检测RNA 的浓度与纯度,质检合格后,取相同量的RNA,根据逆转录与实时荧光定量PCR 试剂盒的说明书,进行实时定量PCR,计算并比较2种细胞Lnc01287 与miR-4500 的拷贝数,实验至少重复3次。

1.6 ELISA 取等量的人肺成纤维细胞与人肺瘢痕成纤维细胞上清液,根据人TGF-βELISA 试剂盒的说明书,依次加入标准品、样品、抗体、酶、显色剂,用酶标仪分别检测标准品及样品的吸光度,制作标准曲线,计算并比较2 种细胞TGF-β的量,实验至少重复3次。

1.7 蛋白质印迹实验 将上述人肺成纤维细胞与人肺瘢痕成纤维细胞及转染后的9组细胞用胰酶消化,离心,弃上清,加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液,充分裂解后,提取总蛋白。BCA 法测定蛋白 浓 度, 制 胶, 上 样, 电 泳, 转 膜, 封 闭,GAPDH、Smad3一抗孵育,洗膜,二抗孵育,洗膜,曝光,用Image J检测每个条带的灰度值。以GAPDH 为内参,计算Smad3 与GAPDH 灰度的比值,比较人肺成纤维细胞与人肺瘢痕成纤维细胞及上述各组细胞Smad3的蛋白量,实验至少重复3次。

1.8 基因相互作用预测 对于Lnc01287 与miR-4500的相互作用及结合位点预测,采用LncBase v.2 (http:／／carolina.imis.athena-innovation.gr／diana_tools／web／index.php？r=lncbasev2%2Findex)。对于miR-4500与TGFBR1的相互作用及 结 合 位 点 预 测,采 用targetscan.org (http:／／www.targetscan.org／vert_71／)。

1.9 双荧光素酶报告基因实验 将3～6代的人肺瘢痕成纤维细胞以105/孔的密度接种在12 孔板中,16 h后分别转染miR-4500阴性对照及过表达质粒,Lnc01287、TGFBR1野生型及miR-4500结合位点突变型荧光素酶质粒,分为两大组,第一大组的4 个小组为Lnc01287 wt+miR-4500 NC、Lnc01287 mut+miR-4500 NC、Lnc01287 wt+miR-4500 mimic、Lnc01287 mut + miR-4500 mimic,第二大组的4 个小组为TGFBR1 wt+miR-4500 NC、TGFBR1 mut+ miR-4500 NC、TGFBR1 wt+miR-4500 mimic、TGFBR1 mut+miR-4500 mimic。转染48 h 后,裂解细胞,取上清,按双荧光素酶报告基因实验的说明书,加入荧光底物和终止液,酶标仪检测并比较每大组的4个小组间荧光素酶反应强度,实验至少重复3次。

1.10 MTT 实验 将上述转染后的9组人肺瘢痕成纤维细胞以4×103/孔的密度接种在96孔板中,培养24 h后,换无血清培养基,再培养24 h。根据MTT 细胞增殖检测试剂盒的说明书,加入MTT,37 ℃孵育4 h,再加入DMSO,震荡摇匀,酶标仪在550 nm 处检测每个孔的吸光度,绘制细胞的增殖曲线,实验至少重复3次。

1.11 统计学分析 采用SPSS 21.0进行统计分析。数据均以±s表示,两组间比较采用t检验,三组及以上比较采用方差分析,柱形图绘制采用GraphPad Prism 5。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2 种细胞Lnc01287 和miR-4500 表达的比较 实时定量PCR 实验显示,相比人肺成纤维细胞,人肺瘢痕成纤维细胞Lnc01287 是高表达的(P＜0.01),而miR-4500 是 低 表 达 的 (P＜0.05)。见图1、2。

图1 人肺成纤维细胞与人肺瘢痕成纤维细胞Lnc01287相对表达量的比较

图2 人肺成纤维细胞与人肺瘢痕成纤维细胞miR-4500相对表达量的比较

2.2 2种细胞TGF-β、Smad3的比较 ELISA 结果显示,相比人肺成纤维细胞,人肺瘢痕成纤维细胞TGF-β是高表达的(P＜0.05),见图3。蛋白质印迹结果显示,相比人肺成纤维细胞,人肺瘢痕成纤维细胞Smad3 是高表达的 (P＜0.05),见图4。以上这些结果提示,相比人肺成纤维细胞,人肺瘢痕成纤维细胞TGF-β/Smad通路是活化的。

图3 人肺成纤维细胞与人肺瘢痕成纤维细胞TGF-β浓度的比较

图4 人肺成纤维细胞与人肺瘢痕成纤维细胞Smad3相对表达量的比较 A:蛋白印迹条带;B:柱状图

2.3 Lnc01287、miR-4500 的靶基因预测LncBase v.2显 示,Lnc01287 与miR-4500 可 能 存在相互作用,Lnc01287的靶基因可能是miR-4500(图5)。Targetscan.org 显 示,miR-4500 与TGFBR1可能存在相互作用,miR-4500的靶基因可能是TGFBR1 (图6)。双荧光素酶报告基因实验显示,对于Lnc01287 wt 组,相比miR-4500 NC,miR-4500 mimic的双荧光素酶反应强度降低(P＜0.05),而对于Lnc01287 mut组,两者间的双荧光素酶反应强度差异无统计学意义 (图7);对 于 TGFBR1 wt 组, 相 比 miR-4500 NC,miR-4500 mimic的双荧光素酶反应强度明显降低(P＜0.01),而对于TGFBR1 mut组,两者间的双荧光素酶反应强度差异无统计学意义(图8)。

图5 Lnc01287与miR-4500的相互作用位点

图6 miR-4500与TGFBR1的相互作用位点

图7 双荧光素酶报告基因实验验证Lnc01287 与miR-4500间存在相互作用

图8 双荧光素酶报告基因实验验证miR-4500与TGFBR1间存在相互作用

2.4 各组人肺瘢痕成纤维细胞中Smad3表达的比较 对于以上转染的9组细胞来说,相比对照组,Lnc01287 mimic 组 与 miR-4500 inhibitor 组 的Smad3 蛋 白 表 达 量 明 显 增 加 (P＜0.01),TGFBR1 mimic组的Smad3蛋白表达量增加(P＜0.05),si-Lnc01287 组 与miR-4500 mimic 组 的Smad3 蛋 白 表 达 量 明 显 减 少 (P＜0.01),si-TGFBR1组的Smad3 蛋白表达量减少 (P＜0.05),Lnc01287 mimic+ miR-4500 mimic 组、miR-4500 inhibitor+si-TGFBR1组的Smad3蛋白表达量与对照组比较差异无统计学意义 (图9)。以上这些结果提示,Lnc01287通过抑制miR-4500,对TGF-β/Smad通路起激活作用。

图9 各组人肺瘢痕成纤维细胞Smad3蛋白相对表达量的比较 A:蛋白印迹条带;B:柱状图

2.5 各组人肺瘢痕成纤维细胞形态的比较 相比对照组,Lnc01287 mimic组、miR-4500 inhibitor组及TGFBR1 mimic组的细胞数量更多,细胞间隙更小;而si-Lnc01287组、miR-4500 mimic组及si-TGFBR1组的多数细胞收缩变圆,细胞间隙增大,细胞贴壁不紧,脱落下来;Lnc01287 mimic+miR-4500 mimic组与miR-4500 inhibitor+si-TGFBR1组中,细胞又恢复典型的长梭形,细胞数量也较之前增加,细胞间隙减小(图10)。

2.6 各组人肺瘢痕成纤维细胞增殖指数的比较MTT 实验显示,相比对照组,Lnc01287 mimic组的细胞增殖指数增加 (P＜0.05),miR-4500 inhibitor组及TGFBR1 mimic组的细胞增殖指数明显增加 (P值均＜0.01),而si-Lnc01287组与miR-4500 mimic组的细胞增殖指数减少 (P值均＜0.05),si-TGFBR1组的细胞增殖指数明显减少 (P＜0.01),Lnc01287 mimic+ miR-4500 mimic组、miR-4500 inhibitor+si-TGFBR1 组的细胞增殖指数与对照组比较差异无统计学意义。见图11。

3 讨论

肺间质纤维化是一种慢性进展性的肺疾病。它的病因有很多,包括吸入烟雾、重金属、农药、化肥、硅尘、病毒感染、遗传变异性因素、特发性等[4]。其中的特发性肺纤维化为病因不明的肺间质纤维化,其发病率逐年升高,目前在欧洲和北美的发病率为0.002 8%～0.018%[5],在亚洲和南美的发病率为0.000 5%～0.004 2%。患者最常见的表现为呼吸困难,呈进行性加重,最终导致呼吸衰竭及死亡,给患者的日常工作和生活带来极大危害。本病治疗棘手,预后不佳,目前主要的治疗手段为对症治疗,但无法有效地减缓疾病的进展,患者从诊断到死亡的中位生存期为2～4年[6]。因此,本病越来越引起呼吸内科工作者的重视。

特发性肺纤维化的发病机制尚不十分清楚,目前认为是遗传因素与环境因素相互作用的结果。在各种不明因素的作用下,肺泡上皮细胞反复慢性损伤,导致肺成纤维细胞转化为肺瘢痕成纤维细胞,分泌大量的细胞外基质,反过来又促进更多肺瘢痕成纤维细胞的生成,形成一个正反馈的恶性循环[7],最终导致肺组织的重塑、肺顺应性的下降及气体交换能力的损害。很多通路的活化参与这一过程,包括Wnt/β-catenin 通 路[8]、TGF-β/Smad通路、Sonic hedgehog通路等,那么,是什么原因导致了这些通路的活化,上游是否有一些始动因子参与,需要进一步研究。

Lnc RNA 与miRNA 是一类非编码RNA,虽然不编码蛋白质,但却对人体的许多生物学功能起重要的调控作用。Lnc RNA 通常通过抑制miRNA的表达,对信号通路起正向的调控作用[9],最终影响机体的生物学功能。

关于Lnc01287,目前的研究不多。关于miR-4500,目前很多研究证实其可作为抑癌基因,可抑制多种肿瘤的进展,如肝癌[10]、非小细胞肺癌[11]等。唯一与纤维化相关的是Kudo等[12]的研究,他们发现miR-4500的过表达可以降低胶原的稳定性,抑制纤维化的进展。

图10 各组人肺瘢痕成纤维细胞形态的比较

图11 各组人肺瘢痕成纤维细胞增殖指数的比较

TGF-β/Smad通路是一条与纤维化密切相关的通路,与许多器官(如肾、肝、肺、心)的纤维化密切相关。这条通路的主要因子是TGF-β、TGFBR1、Smad3,当细胞间质中的TGF-β 与受体TGFBR1结合后,这条通路被激活,胞质中的Smad3活化,转位到细胞核,与纤维化相关靶基因结合,促进基因的转录[3]。在糖尿病肾病小鼠模型中,敲除TGF-β或Smad3能够抑制肾小管上皮细胞的间质转化,降低波形蛋白的表达水平,显著地减缓肾纤维化的进展[13]。TGF-β与Smad3能导致肝星状细胞的活化,产生过多的细胞外基质,促进肝纤维化的进展[14]。在肺纤维化小鼠模型中,抑制TGF-β/Smad通路的活化能够减缓疾病的进展[15]。在心肌纤维化中,TGF-β/Smad 通路是活化的,导致心肌成纤维细胞的增生与胶原Ⅰ分泌的显著增加[16]。那么,Lnc01287 是否通过抑制miR-4500的表达,进而增强TGF-β/Smad通路的活性,最终促进人肺瘢痕成纤维细胞与特发性肺纤维化的进展呢? 这是本研究需要解决的问题。

本研究证实,在人肺瘢痕成纤维细胞中,Lnc01287、TGF-β/Smad 通 路 是 高 表 达 的,而miR-4500是低表达的。Lnc01287可能通过作用于miR-4500,抑制它的表达,miR-4500的低表达又作用于TGFBR1,激活TGF-β/Smad 通路,导致Smad3表达增加,增强人肺瘢痕成纤维细胞的增殖活性,最终促进特发性肺纤维化的进展。因此,Lnc01287是治疗特发性肺纤维化的很有希望的靶点,可针对此开发治疗特发性肺纤维化的药物,有效地减缓此病的进展。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突