红花治疗动脉粥样硬化潜在靶点及机制

张玉婕， 朱静华， 王祖禄， 闫承慧， 韩雅玲

1.北部战区总医院 心血管内科，辽宁 沈阳110016；2.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847

心血管并发症是世界范围内死亡的主要原因，大多心血管并发症的潜在病理生理学是动脉粥样硬化[1]，特征为大中型血管中形成富含脂质的斑块，动脉粥样硬化是动脉壁的一种慢性炎症性疾病[2]。红花为菊科植物红花的干燥花，性温，味辛，归心、肝经，具有活血通经、散瘀止痛之功效，用于治疗经闭、痛经、恶露不行、症瘕痞块、胸痹心痛、瘀滞腹痛、胸胁刺痛、跌扑损伤、疮疡肿痛等[3]。有研究表明，在治疗动脉粥样硬化中，红花具有抗炎、抗血小板聚集、抗缺血作用，但具体机制不明[4]。网络药理学基于系统生物学理论，对药物有效成分进行多靶点、多途径的生物系统网络图分析[5]。从中医学角度阐明中药成分-靶点-疾病基因之间的关系、寻找发挥治疗作用的关键靶点及通路可为疾病的临床治疗提供理论依据。本研究通过网络药理学的方法筛选红花中的有效化学成分，预测其与动脉粥样硬化相关的靶点及信号通路。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 红花化学成分及靶点收集 红花的化学成分及靶点通过传统中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Databaseand Analysis Platform，TCMSP；http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)获得。该数据库和分析平台包括化学成分、靶点、药物-靶点网络、相关的药物-靶点-疾病网络，以及天然化合物的药代动力学特性，如口服生物利用度(oral bioavailability，OB)、类药性(drug-likeness，DL)、血脑屏障等[6]。根据吸收、分布、代谢和排泄筛选化学成分，并利用药代动力学信息检索筛选出阈值OB≥30.00%、DL≥0.18的化学成分进一步分析[7-8]。经TCMSP检索的靶蛋白通过蛋白数据库(Uniprot；https://www.uniprot.org/)[9]将蛋白名称转换为基因ID名称。

1.2 动脉粥样硬化靶点收集动脉粥样硬化相关的疾病靶基因 从DisGeNET和GeneCards数据库中获得靶基因，去除重复的靶点。通过ImageGP平台将红花中有效成分对应的靶点和动脉粥样硬化的疾病靶点进行匹配重合[10]，绘制韦恩图，获得红花中具有治疗动脉粥样硬化作用的关键靶点。

1.3 靶蛋白相互作用网络图构建 采用STRING数据库(https://string-db.org/)[11]进行靶蛋白相互作用网络图的构建，将红花与动脉粥样硬化共同的靶点导入STRING数据库，物种设置为“Homo Sapiens”，获得靶点相互作用信息。将结果导入到Cytoscape软件[12]，绘制并分析交互网络，设置网络中节点大小、颜色深浅与Degree值相对应，即节点越大、颜色越深代表Degree值越高。

1.4 生物功能注释基因富集分析和基因组百科全书代谢通路富集分析 采用Metascape数据库(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)[13]对红花治疗动脉粥样硬化的关键靶点进行生物功能注释(Gene Ontology，Go)基因富集分析和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)代谢通路富集分析，分析红花中的主要分子生物过程和信号通路，其中，Go富集和KEGG通路富集分析的结果均以条形图的形式进行展示。

2 结果

2.1 红花活性成分筛选 红花的化学成分有23个，其中，16个化学成分满足OB≥30.00%、DL≥0.18(表1)。

表1 红花有效活性成分表

2.2 红花活性成分的潜在靶点预测 红花中有449个预测靶点，剔除重叠靶点后，得到178个靶点。具有靶点最多的活性成分是槲皮素，然后依次是木犀草素、山奈酚、黄芩苷、β-谷甾醇、豆甾醇，靶点个数分别为128、57、51、30、27、23个。

2.3 动脉粥样硬化潜在靶点预测 红花中具有治疗动脉粥样硬化作用的关键靶点有55个(图1，表2)。

图1 红花与动脉粥样硬化靶基因匹配图

表2 红花潜在靶点信息列表

2.4 红花与动脉粥样硬化共同靶点分析 将红花与动脉粥样硬化共同的55个靶点导入STRING数据库，获得了包含55个节点和850条边的网络图，平均节点度值为30.91。Cytoscape软件构建蛋白质相互作用网络，关联强度前10位的靶点分别是白细胞介素-6、白蛋白、肿瘤坏死因子、血管内皮生长因子、白细胞介素-8、趋化因子2、苏氨酸激酶1、前列腺素内过氧化物合酶2、基质金属蛋白酶9、白细胞介素-1β(图2)。

2.5 关键靶基因Go分析 Go-细胞成分分析可见，富集前9位细胞成分主要是小窝蛋白、RNA聚合酶Ⅱ转录因子复合物、细胞外基质、分泌颗粒腔隙、内质网内腔、富含Ficolin-1颗粒腔、蛋白质-基因复合物、质膜外侧、质膜蛋白复合物(图3a)。Go-分子功能分析可见，富集前10位分子功能主要是细胞因子活性、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合、细胞核受体活性、丝氨酸型内肽酶活性、血红素结合、整合素结合、磷酸酶结合、蛋白酶结合、蛋白质同源二聚体活性、蛋白激酶结合(图3b)。Go-生物学过程分析可见，富集前10位生物学过程主要是细胞因子调节的信号通路、对脂多糖的反应、氧化应激反应、细胞迁移的正调控、活性氧代谢过程、白细胞-细胞粘附的调节、白细胞迁移、对有毒物质的反应、对细胞外刺激的反应、凋亡信号通路的调控(图3c)。

图2 红花治疗动脉粥样硬化的靶点相互作用网络

2.6 关键靶基因KEGG分析 对55个关键靶基因进行KEGG分析，并以P<0.01为阈值筛选出前10条通路，分别为流体剪切应力与动脉粥样硬化、白细胞介素-17信号通路、疟疾、癌症途径、HIF-1信号通路、弓形虫病、丙型肝炎、T细胞受体信号通路、癌症中的转录失调、HTLV-Ⅰ感染(图4)。

图3 红花有效化学成分潜在靶点Go分析(a.细胞成分分析；b.分子功能分析；c.生物学过程分析)

图4 红花有效化学成分潜在靶点KEGG分析

3 讨论

动脉粥样硬化是临床常见疾病，致病过程复杂，中医根据其临床症状将其归属于“中风”“眩晕”“偏枯”等范畴[14]。中药红花对心肌缺血、心肌梗死等心血管疾病具有良好的疗效，但关于其治疗动脉粥样硬化相关靶点和信号通路的研究较少。

本研究发现，红花中具有治疗动脉粥样硬化作用的化学成分主要是槲皮素、木犀草素、山奈酚、黄芩苷、β-谷甾醇、豆甾醇等。炎症和氧化应激反应在动脉粥样硬化的发生和发展中起着重要作用。有研究报道，槲皮素可通过调节AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路抑制炎症和氧化应激反应，进而减轻糖尿病高脂饮食诱导的大鼠颈动脉粥样硬化[15]。木犀草素是一种存在于多种药材中的天然黄酮类化合物，具有抗炎、抗纤维化等药理作用。木犀草素能够通过调节信号转导子和转录激活子3介导的炎症反应来改善高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化[16]。氧化低密度脂蛋白会诱导内皮细胞凋亡，参与动脉粥样硬化的发生和发展，山奈酚通过抑制TLR4/NF-κB通路上调miR-26a-5p，减轻氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞凋亡，防治动脉粥样硬化[17]。黄芩素是一种有效的抗动脉粥样硬化的化合物，可通过调节氧化应激反应发挥作用[18]。

红花可通过调节多个靶点，如白细胞介素-6、白蛋白、肿瘤坏死因子、血管内皮生长因子、白细胞介素-8、趋化因子2、苏氨酸激酶1等靶蛋白在改善动脉粥样硬化中发挥作用。通过对红花抗动脉粥样硬化的核心靶点进行KEGG分析发现，红花主要通过流体剪切应力与动脉粥样硬化、白细胞介素-17信号通路、HIF-1信号通路、T细胞受体信号通路等治疗动脉粥样硬化。NF-κB介导的炎症反应通路在动脉粥样硬化的形成和发展中发挥重要作用[19]，NF-κB活性增强能够促进白细胞介素-6、白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子等细胞因子表达，损伤血管内皮损伤，促进单核巨噬细胞向血管内皮细胞粘附[20]。血管内皮生长因子可促进内皮细胞增殖、巨噬细胞浸润、泡沫细胞形成，影响动脉粥样硬化发病[21]。白细胞介素-8是一种炎症因子，G31P可拮抗白细胞介素-8受体，通过调节Rho激酶、ERK和钙依赖通路抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移[22]。单核细胞和中性粒细胞在动脉粥样硬化病变的早期积聚，白细胞的积聚受到其与激活内皮细胞相互作用的调控，这种调控由内皮细胞粘附分子、趋化因子及其各自的受体协调发挥作用，动脉血管趋化因子2表达上调会促进白细胞向动脉粥样硬化病变迁移[23]。除了炎症和氧化应激反应，脂质浸润、血管平滑肌细胞激活、免疫反应等均参与动脉粥样硬化的发生和发展。由此可见，红花主要通过调节炎症、氧化应激及免疫反应等治疗动脉粥样硬化。

综上所述，本研究采用网络药理学研究方法探讨红花治疗动脉粥样硬化的活性成分、靶点及作用机制，通过构建相关网络图直观地发现红花治疗动脉粥样硬化具有多成分-多靶点-多途径的特点，与中医药治疗疾病的特点相吻合，相较于西药单一作用，其优势更佳明显。