工业酶制剂的发展与应用研究

赵琳，宋瑞瑞，吴希，吴琦，云振宇

(中国标准化研究院 农业食品标准化研究所，北京 100191)

酶制剂是现代生物技术快速发展的产物。从古代开始，在自然界中发现的酶，包括来源于微生物及动植物如小牛的瘤胃或木瓜中的酶，就被应用于奶酪、葡萄酒、醋等食物的生产，以及日用品如皮革、靛蓝和亚麻布等的制造。由于技术的限制，人们对这些酶的特性认识不足，更没有纯化及表征手段。20世纪后半叶，随着发酵工程的发展和表征技术的成熟，酶制剂被逐渐发现、纯化和应用，实现了利用菌株进行大规模生产。随着生物技术和计算机科学等现代化技术的成熟和发展，人们挖掘出越来越多的酶制剂，并且利用随机突变、理性设计或半理性设计等技术改造现有的酶[1-4]。酶制剂的底物谱越来越广泛，催化类型更加多样化，能够适用于多种反应条件，甚至可以在极端条件下保持催化活性，这使得酶制剂真正进入到洗涤剂[5-6]、饲料[7-9]、食品[10-11]、纺织[12-14]等工业产品和生产过程中。酶制剂的使用不仅改变了各行各业的生产方式，也促使人类的饮食结构及生活方式发生了巨大的改变。

1 酶的分类

随着生物化学、分子生物学等生命科学与技术的发展，人们对生物酶有了更好的认知和分离纯化手段，应用的酶的种类大幅增加。国际生物化学与分子生物学联盟(IUBMB)根据酶催化反应的类型将酶分为六大类[15]。

1.1 氧化还原酶

所有催化氧化还原反应的酶都属于这个分类，如乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、过氧化物酶、过氧化氢酶等，氧化的底物作为氢供体。

1.2 转移酶

转移酶是将一个基团如甲基基团或糖基基团从一个化合物(供体)转移到另一个化合物(受体)的酶，如磷酸化酶、转氨酶、转甲基酶等。

1.3 水解酶

这些酶催化水解使C—O、C—N、C—C、磷酸键或其他键断裂，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶等。

1.4 裂解酶

裂解酶是通过消除、形成双键或环状结构、在双键上增加基团等方式使 C—C、C—O、C—N或其他键断裂，如柠檬酸合成酶、醛缩酶等。

1.5 异构酶

这些酶催化分子内部结构变化，如磷酸丙糖异构酶等。

1.6 连接酶

连接酶催化两个分子的连接。连接反应通常与ATP或三磷酸盐的分解相偶联，如谷氨酰胺合成酶等。

因酶催化作用具有高效、专一、条件温和、催化活性可控等优点，其被广泛应用到各种工业化生产加工过程中。工业酶制剂大多数都是起水解作用的，用来对多种天然产物进行降解，其中蛋白酶主要在清洁剂和乳制品行业中广泛应用，淀粉酶和纤维素酶主要在淀粉转化、纺织品和食品等行业应用；在食品工业中经常应用的酶类还有脱氢酶类、氧化酶类、过氧化物酶类及氧合酶类等，如乳酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、脂肪氧合酶等，仅次于水解酶的应用。

2 工业酶的生产

工业酶是利用细菌、真菌等微生物在严格控制的条件下发酵产生。实践生产中绝大多数微生物酶都集中来自特定的属，其中曲霉、木霉属、芽孢杆菌和酵母菌物种占主要部分[16]。在选择生产菌株时必须从几个方面考虑：理想情况下，酶由细胞分泌，这会使得回收和纯化过程比细胞内酶的生产要简单得多，因为细胞内酶必须从成千上万种不同的细胞蛋白和组分中纯化；其次，生产宿主须是GRAS状态(一般被认为是安全的)，尤其是生物体生产的酶要用于食品加工过程；第三，生物体需要能够在合理时间内产生大量的所需的酶[17]。

工业中使用的许多微生物都被改造以高效率生产所需酶，同时不产生其它副产品。Leisola等[18]将酶生产过程分为以下几个阶段(图1)：①酶的选择；②生产菌株的选择；③利用生物工程技术构建高产菌株；④培养基及生产条件优化；⑤回收工艺优化；⑥利用稳定剂等方法增加酶的稳定性。

图1 工业酶制剂生产过程

工业酶的选择标准需要考虑其特异性、反应速率、pH值与温度、稳定性、抑制剂的效果和对底物的亲和力等[18]。同样，也可以通过改进生产酶的技术来适应工业生产中化学反应的类型和操作条件，如温度、pH值和反应动力学等。在过去的几十年里，酶技术领域的深入研究为改善酶的实际应用效果提供了许多可行的方法。其中，固定催化技术的发展为开发更高效的、经济的，能应用于工业、废物处理、医药、生物传感器的生物催化剂提供了可能[19-20]。现在已经开发出许多可用于固定酶的技术手段，大致可分为四大类，即包封、共价结合、交联和吸附。特定技术的选择取决于酶的性质、底物的性质和酶的最终用途[21-22]。D′Souza[23]指出，酶固定化是将酶和固定基质相结合，使酶在生物反应器中保持稳定，并且能够重复利用。固定化通常能稳定酶的结构，使酶能在极端的pH、温度或特定有机溶剂等条件下工作，而且能够获得高纯度的产品，尤其食品加工和制药行业中产品的纯度非常重要，因为杂质会造成毒理、免疫学等严重问题，此外，酶固定化还能更好地控制酶促反应效率和反应时间，这在食品行业特别是在涉及易腐商品以及其他不稳定的底物，中间体或产品中具有重要意义[24]。

3 工业酶的应用

酶在工业用途中有着极大的吸引力，不仅因为酶对从底物到产物的生物转化有高度选择性和高效性，还因为酶催化是产物相对比较单一的反应，能够最大限度地减少废物产生。根据应用将工业酶简单分为四大类，即洗涤用酶、技术酶、食品和饲料行业用酶。技术酶进一步分为纺织用酶、皮革用酶、造纸用酶、精细化学用酶、乙醇燃料生产用酶等[25]。表1 中所展示的是酶在多种工业环节中的应用及用途，酶工业已经是一个高度多样化的产业，并且其在大小和复杂性方面仍在发展。

表1 在多种工业环节中应用的酶及用途

3.1 清洁剂工业

工业酶制剂被用来作为清洁剂的添加剂仍然是其最大的用途。蛋白酶、淀粉酶以及纤维素酶都能提供多种清洁效果，如有效地清除特殊污渍。蛋白酶一般源于动物内脏、植物茎叶和果实及微生物中，根据其最适反应的pH值可划分为碱性蛋白酶、酸性蛋白酶和中性蛋白酶，碱性蛋白酶应用最广泛。蛋白酶是催化肽键水解的酶，因此，可应用于织物上的汗渍、血渍、奶渍及其他食物汁液等的清洗；淀粉酶可将淀粉类污垢水解，并与其他酶有较好的兼容性，在洗涤工业中得到大量的应用；脂肪酶能将甘油三酯分解成易清除的脂肪酸、甘油二酯、甘油一酯和甘油等，使得油污的清洁效果大大增加；纤维素酶在洗涤液中主要发挥柔软、增色衣物的作用[26]。这些酶制剂可以满足对清洁剂性能的要求，并且其组分也在不断地发展。酶与清洁剂组分的兼容性(例如，典型的稳定性能)是影响酶制剂在清洁剂中使用的主要因素。最近第二代清洁用酶制剂，如新型淀粉酶，在低温和碱性pH条件下的活性有了显著提高，同时还保持着在清洁剂应用条件下必要的稳定性。这些新型酶制剂都是通过微生物菌种选育和蛋白质工程手段进行功效改善[27]。在低温和碱性pH条件下显示出活性与稳定性的蛋白酶也已经从自然界中分离出来，应用定向进化的方法来进一步对其优化改进[28]，使该类蛋白酶更适用于清洁剂工业。

此外，现阶段人们生活方式发生很大的变化，产生的污渍不仅来源广泛，成分也更复杂，通常包含有淀粉、蛋白质、色素、油污等多种成分，单一的酶制剂难以达到理性的去污效果，需要开发包含多种酶的复合酶制剂发挥协同作用[29]。但是目前我国大部分洗涤产品仍采用单一的酶制剂，只有少数洗涤产品同时使用了两种酶，而在国外发达市场上的洗涤剂通常含有淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、甘露聚糖酶以及两种不同功效的纤维素酶共7种酶制剂，因此，我国洗涤剂工业还未充分挖掘复合酶制剂的应用价值。

3.2 淀粉转化

淀粉到果葡糖浆的酶转化是一个确定的生物催化过程，淀粉工业过程中连续应用酶制剂是非常必要的。酶取代淀粉加工工业中的酸，不仅提高了催化效率，同时也降低了对环境的污染。淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类的统称，根据其作用的糖苷键和反应后产生的糖端基团不同可分为四类，即α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶[30]。目前，α-淀粉酶是我国生产量最大的工业酶制剂之一，也是淀粉工业中最为重要的酶制剂，淀粉水解转化的第一步就是在α-淀粉酶的作用下转化成为麦芽糊精，但伴随着蒸汽的注入，使得对于酶的热稳定性有很高的要求。应用传统的α-淀粉酶时，pH值需要调整到一个很高的水平，并且必须添加钙离子来稳定酶制剂。在淀粉工业中应用的酶制剂经历着不断地改进，性能得到优化的新的α-淀粉酶已经得到发展，例如提高了热稳定性、耐酸性以及在不添加钙离子的情况下发挥作用的能力[31-32]，从而为淀粉工业提供了显著的效益。工业上通常利用枯草芽孢杆菌、淀粉芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、米曲霉和黑曲霉来发酵生产淀粉酶，而α-淀粉酶主要源于芽孢杆菌属。现代生物工程技术手段已经被应用来开发性能改善和产量高的α-淀粉酶[33-34]。常用的育种方式有从诱变育种、基因工程育种等，发酵生产方式有液体深层发酵、固态发酵等[30]。杨力权等从云南大理市弥渡县石夹泉的55 ℃底泥中筛选出一株高温淀粉酶的高产菌，经鉴定为苏云金芽孢杆菌，产生的淀粉酶最适酶反应温度为75 ℃，最适反应pH值为5.0，Ca2+、K+、Mg2+、Fe2+、Cu2+均对该酶活力具有促进作用，Fe2+对该酶具有明显的促进作用，一定程度上扩大了淀粉酶的应用条件范围[35]。

3.3 纺织应用

纺织行业巨大的能源和水资源消耗以及随后的环境污染，使该行业处在相当大的能源环境压力下。例如，在棉花的加工过程中，能源和水消耗最多的步骤之一是洗擦步骤，这一步骤在高温和很强的碱性条件下进行，旨在清除多种在纤维素纤维上残留的细胞壁成分。近些年，一个在更低的温度下进行和应用更少的水的，以果胶裂解酶为基础的加工过程已经广泛应用[36]。应用酶制剂的新工艺已经被引进到棉纺织品制造业的主要加工过程中，这些酶制剂的应用对纺织工业和环境都是有益的。酶制剂在纺织品前处理过程即退浆、精炼、毛纺中炭化、丝绸脱胶、漂白等过程，以及纺织品后整理过程即改善纤维表面的外观和手感、改善毛织物防毡缩等过程均有应用。如淀粉酶能够催化织物上的淀粉浆料水解，常应用于退浆过程；果胶酶能够清除织物表面的果胶质，常被应用于精炼过程；纤维素酶可以使纤维膨化，除去毛织物中的草刺等纤维物质，并改善纤维表面的外观和手感等，在纺织品多个加工过程中均有应用[37]；漆酶可以对棉、麻、羊毛等多种天然纤维的疏水性、染色性、抗皱性、吸湿性等性能进行改良，以达到提高棉织物的漂白效果、增强纺织物的生物染色，纺织染料的脱色和脱毒等目的，是纺织工业中十分重要的酶制剂之一[38]。但是，单一酶制剂的催化作用相对专一，通常在应用过程中使用多种酶制剂，通过协同作用提高纺织加工效果。

3.4 饲料工业

饲料酶制剂作为安全、有效、无残留的饲料添加剂已经被广泛的应用于养殖业。酶制剂在饲料工业中的功能主要包括：营养利用、维持肠道健康、生理调控、免疫调控、脱毒解毒、抑菌杀菌以及抗氧化作用。单一种类的酶制剂功能存在局限性，因此常依据目的采用多种酶制剂或搭配其他相关制剂一起应用。此外酶作为饲料中抗生物素的替代品能够有效地改善动物的营养物质代谢进而提高生产性能，增加抑菌、杀菌能力从而保持良好的健康状态，具体表现在五个方面：即①提高动物体营养消化功能，改善动物体生产性能；②降低有害微生物的生长和繁殖；③降低日粮免疫原性应激，减少肠道坏死；④杀害病原菌；⑤产生功能性寡糖和寡肽，控制有害微生物[39]。例如，木聚糖酶和β-葡聚糖酶被应用在谷物为基础的单胃动物饲料中，单胃动物与反刍动物相反，不能充分地降解和利用包含大量纤维素和半纤维素的植物基饲料。近些年天然磷的利用备受关注。全部植物85%～90%的磷存在于植酸磷中，动物自身不能分泌植酸酶，加之植酸磷会结合矿物质等其他营养物质，进一步降低了植酸磷的利用率，在饲料中添加植酸酶是提高植酸磷利用率的有效方式。在饲料中添加植酸酶不仅能够增加植酸磷的利用率，而且降低了饲料中无机磷的添加，节约成本又减少磷排放，因此植酸酶已经发展成为饲料工业中最大的酶制剂部分[40]。随着饲料酶制剂技术的发展，植酸酶的适用性和性能都得到了改善[41]。通过定点突变的新方法，研究人员制备出有更高催化活性的真菌性植酸酶。此外，磷的利用并不是动物饲料工业唯一关注的问题，研究人员一直努力探索从多种饲料来源中获取更高的营养价值，例如增加大豆粉中蛋白质的可消化性。未来会有不同的水解酶应用到饲料工业中来增加原料的价值，从而降低每一个家畜的能源消耗和污染。

3.5 食品工业

食品工业中酶制剂的应用很广泛，从酿酒与果汁等饮料工业、乳品工业到烘培工业、水产品加工、肉制品加工、油脂加工等多个行业。谷氨酰胺转氨酶作为结构助剂应用到香肠、挂面和酸奶的加工过程中，通过蛋白的相互交联可以为产品提高黏弹性能[42]。磷脂酶可以用来替代或补充传统的乳化剂，因为这种酶可以原位降解极性小麦脂类来产生乳化的脂质。在烘焙工业中，面包中的淀粉和半纤维素负责水结合力和保水力，而它们分别是α-淀粉酶和木聚糖酶的底物，酶制剂的使用对于保持面包的柔软度和弹性是非常重要的。此外，淀粉酶可以在某种程度上降解支链淀粉，从而在凝胶化作用后阻止再结晶，而非完全降解支链淀粉网络，为面包提供弹性。在酿酒与果汁等饮料工业，虫漆酶可以催化多酚类的交联，通过过滤可以轻松地去除多酚，被用来进行果汁的澄净以及啤酒中香味的增加。在脂肪和油类工业中，以粒化二氧化硅为基础的固定化脂肪酶的加工过程显著地降低了加工成本，并且基于这种新材料的加工过程现在正被应用于商品化不含反式脂肪酸的脂肪和油类的生产[43]。从食品加工过程角度分析，酶制剂在食品原料加工、食品生产过程以及食品保鲜等均有所应用。食品原料常用的酶制剂有果胶酶、乳糖酶、蛋白酶等，能改善食品原料的组织结构，进而提高食品品质和口感；食品生产过程中应用的酶制剂有淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，主要应用于天然食品添加剂的制备过程，而在保健食品工业中，酶制剂的加入可以促使生物大分子的降解，以获取具有特定生物功能的小分子物质，如氨基酸、多肽等，促进人体生命健康；食品保鲜中应用的酶有葡萄糖氧化酶、谷氨酰胺转氨酶、溶菌酶等，避免营养成分因环境因素而破坏或者食品变质，抑制微生物的生长繁殖，保证食品质量和安全，延长食品的货架期[44-45]。此外，应用高选择性的微生物磷脂酶能有效清除植物油(脱胶)中的磷脂[46]，促进能源和水的节约，对工业和环境都极有益处。

3.6 有机合成中应用

化学合成被认为是应用酶催化最有前途的领域。虽然如此，化学工业实施酶制剂为基础的进程缓慢，并且对酶的应用也慢于其他工业。酶制剂在这个领域的使用显著增长以及以酶制剂为基础的过程正被广泛引进到多种多样的化学品的生产中。脂肪酶对手性化合物具有较好的立体选择性，如在药品和农药的制造生产中应用的单一对映体中间产物的产生过程，应用脂肪酶来生产乙醇和酰胺的对映异构体以及应用腈水解酶来生产半合成青霉素[47]；细胞色素P450能够催化多种类型的反应，可识别芳香族、聚酮类、萜类、肽类、糖类等不同结构的底物，是自然界中催化性能最高的生物催化剂，在有机合成中也得到良好的应用[48]。

4 总结与展望

酶具有高效、专一、反应条件温和、催化活性可控、绿色环保等特点，被广泛应用于清洁剂、淀粉转化、纺织、食品、有机合成等工业的生产加工过程中，为人类生活提供了极大便利。但由于工业条件中的底物浓度、剪切力、温度、有机溶剂等各种因素的干扰，一定程度上也限制了现有酶制剂的应用。因此，一方面需要改善工业生产的工艺条件；另一方面，急需开发一批具有新活性的酶制剂，克服现有工业条件的限制。

生物信息学的进展和基因序列数据的挖掘分析极大地增加了从自然界中分离目标基因的效率。基于蛋白质结构以及其相关的生物化学与生物物理学性能的蛋白质工程技术为酶的优化提供了一个新的、有价值的工具，进一步改变了工业酶制剂的发展，使得提供特制的酶制剂成为可能，酶制剂具有新的活性并且适用于新的工艺条件，扩展了酶的工业用途。此外，随着纳米生物技术、分子定向进化、离子液体反应介质等技术的成熟和发展，酶制剂的产量、活性以及稳定性等均得到了极大的提高，将进一步扩大酶制剂的应用范围，为现代工业高效生产提供有力保证。同时由于酶制剂结构和生产的复杂性，使得质量控制的复杂程度也相应提高。因此，建立酶制剂标准体系及研制重要质量标准对规范工业酶制剂行业、推动酶制剂的发展和应用有着重要意义。