siRNA干扰URG11表达对骨肉瘤细胞系MG63的生物学功能和Wnt/β-catenin信号通路的影响

董成功 张蔚 刘颖 张明

烟台市烟台山医院病理科 264002

0 引 言

骨肉瘤是一种高度恶性的成骨性肿瘤，起源于间充质细胞，是肿瘤细胞直接形成骨样基质的恶性肿瘤。骨肉瘤好发于青少年，可导致骨痛、肌肉萎缩、病理性骨折等一系列病变，给人体健康和生活质量构成重大威胁[1]。目前，尽管手术切除联合术后放化疗等治疗手段使骨肉瘤患者的生存率有了很大提高，但一些复发和转移病例的治疗效果并不理想[2-3]。随着分子生物学研究的不断发展，从细胞分子水平上研究骨肉瘤发生、发展机制成为当代医学领域的一大热点。

上调基因11（up-regulated gene 11，URG11）可被乙肝病毒HBx蛋白上调，该基因含有特殊的植物凝集素结构域和血管黏附分子结构域，两者参与了细胞黏附、迁移以及信号转导等生物学活动的调节[4-5]。研究结果显示，在肝癌、前列腺癌和肠癌等多种肿瘤的细胞和组织中，URG11异常高表达[6-8]。近些年来，有研究结果证实，骨肉瘤细胞也存在URG11表达上调，而且URG11高表达与肿瘤分期、肺转移等临床特征密切相关[5]，下调URG11能抑制细胞的恶性表型[9]。然而，URG11影响骨肉瘤细胞恶性表型的具体机制尚不明确。

Wnt是一类分泌型糖蛋白，通过自分泌或旁分泌途径发挥作用。β-catenin是Wnt信号通路中的重要参与者，为多功能蛋白。研究结果显示，Wnt/βcatenin参与了机体诸多生物学功能的调节，且Wnt/β-catenin信号通路的异常与肿瘤的发生、发展密切相关[10]。

本研究以人骨肉瘤细胞系MG63为研究对象，采用siRNA干扰URG11的表达，研究URG11对Wnt/β-catenin信号通路的调节与MG63细胞生物学功能的关系。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

MG63人骨肉瘤细胞系（美国ATCC公司），胰蛋白酶、胎牛血清（美国Gibco公司），1640培养基、青链霉素双抗、聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜、TRIZOL和脂质体2000（美国Invitrogen公司），通用蛋白裂解液（南京凯基生物科技发展有限公司），二辛可酸(bicinchoninic acid，BCA)法蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），羊抗兔/鼠二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗体和鼠抗人原癌基因（c-Myc）、基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）单克隆抗体（美国Santa Cruz公司），兔抗人周期性调控因子D1（Cyclin D1）、β-catenin、凋亡抑制基因（Survivin）单克隆抗体（美国CST公司），Matrigel基底胶（美国BD公司），Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（北京Solarbio公司），CCK-8试剂盒（日本Dojindo公司），逆转录试剂盒（大连宝生物工程有限公司）。

Transwell小室（美国Costar公司），酶标仪、凝胶成像分析仪（美国Bio-Rad公司），恒温CO2培养箱、荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PC R）分析仪（美国Thermo Fisher公司），流式细胞仪（德国Eppendorf公司），倒置显微镜（日本Nikon公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、分组与处理

MG63人骨肉瘤细胞系采用含10%热灭活的胎牛血清和1%青链霉素双抗的1640培养基进行培养（5%CO2、37℃）。实验分为Control组（未转染）、NC-siRNA组（转染非特性NC-siRNA）和URG11-siRNA组（转染URG11-siRNA）。收集处于对数生长期的MG63细胞，接种至24孔板（105个细胞/孔），常规培养。当细胞汇合度达70%左右时，根据厂商的说明书，采用脂质体2000进行瞬时转染（每组3个复孔）。其中URG11-siRNA（5’-CACACCCAUUCCUCUACUU-3’）和NC-siRNA（5’-UUCUCCCAACCUCUCACCU-3’）由上海吉玛公司合成。转染后5 h，更换新鲜培养液，细胞继续培养48 h，收集后进行后续检测。

1.2.2 URG11 mRNA表达的检测

采用逆转录PCR（reverse transcription PCR，RTPCR）法检测URG11 mRNA表达。采用TRIZOL提取Control组、NC-siRNA组和URG11-siRNA组细胞的总RNA，并参照逆转录试剂盒的说明书合成单链cDNA。以1μl cDNA为模板，与各0.5μl正反引物、10μl SYBR Green Master Mix（2×）和8μl双蒸馏水混合后配制成PCR反应体系（体积20μl）。PCR反应条件：预变性处理（95℃，2 min）；变性处理（95℃，20 s）；退火（60℃，30 s）；延伸（72℃，30 s）；共反应40个循环。采用比较CT（cycle-threshold）值法对样品扩增进行计算，获得各组细胞URG11 mRNA的样本的相对表达量（2-ΔΔCT）。以GAPDH作为内参。PCR引物由上海生工生物合成，序列见表1，每组实验重复3次。

表1 实时定量PCR引物序列

1.2.3 URG11蛋白表达的检测

采用Western blot法检测URG11的蛋白表达。采用蛋白裂解液提取各组MG63细胞的总蛋白，以BCA法检测总蛋白浓度。向蛋白样品中加入等体积的上样缓冲液（loading buffer），充分混匀后于沸水中进行蛋白变性处理5 min。然后将热变性后的蛋白样品加至SDS-PAGE凝胶的齿状槽中（每孔60μg）行电泳分离。分离结束后，将蛋白电转至PVDF膜。PVDF膜经5%脱脂奶粉封闭2 h，然后分别采用URG11（1∶1 000稀释）和GAPDH（1∶1 000稀释）一抗进行孵育（4℃、24 h）。再经二抗工作液（1∶2 000稀释）室温孵育1 h后，暗室内显影曝光。采用凝胶成像分析仪扫描分析。每组实验重复3次。

1.2.4 细胞增殖实验

采用CCK-8法检测细胞增殖。采用胰蛋白酶消化处理Control组、NC-siRNA组和URG11-siRNA组的细胞，离心后收集细胞，进而接种至96孔细胞板（200μl/孔；浓度为104个细胞/ml），每组设置3个复孔。细胞常规培养，分别在培养1 d、2 d、3 d和4 d时，弃培养液，加入CCK-8试剂（10μl/孔）后孵育2 h，采用酶标仪检测各组细胞在490 nm处的吸光度。每组实验重复3次。

1.2.5 细胞侵袭实验

采用Transwell小室检测细胞的侵袭性。以50 mg/L的Matrigel稀释液（1∶8稀释）包被Transwell小室底部，并在4℃下充分融合。将包被后的小室置于24孔板中，在小室上室中加入经无血清培养基重悬后的细胞（浓度为105个细胞/ml，200μl/孔），在下室中加入500μl含血清的培养基，每组设置3个复孔。细胞常规培养24 h后，取出小室，用磷酸缓冲盐溶液洗涤，以棉签擦去上室细胞后分别采用4%多聚甲醛和0.5%结晶紫进行固定和染色。洗去染色液后，在显微镜下每孔随机选取3个视野观察侵袭穿膜细胞数量。每组实验重复3次。

1.2.6 细胞凋亡实验

采用流式细胞仪检测细胞凋亡。采用胰蛋白酶消化处理Control组、NC-siRNA组和URG11-siRNA组的细胞，离心后收集细胞，以磷酸缓冲盐溶液洗涤2次后，加入结合缓冲液600μl调整细胞浓度。向105个细胞中加入Annexin-V-FITC和PI各5μl，避光反应15 min后，补加上样缓冲液200μl，用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。每组实验重复3次。

1.2.7 Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达

收集URG11-siRNA组、NC-siRNA组和Control组细胞，采用Western blot法检测Wnt/β-catenin信号通路相关分子（β-catenin、c-Myc、Cyclin D1、MMP-2和Survivin）的蛋白表达。详细的检测步骤参照1.2.3节。

1.3 统计学方法

采用SPSS22.0软件进行统计学分析。实验数据以均值±标准差（Mean±SD）表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间多重比较采用SNKq，两组间比较采用独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 URG11-siRNA转染后各组MG63细胞中URG11的表达

与Control组相比，URG11-siRNA组的MG63细胞中URG11 mRNA和蛋白表达均明显降低（均P<0.05），而转染NC-siRNA对MG63细胞的URG11表达的影响无统计学意义（均P＞0.05）。（图1）

图1 URG11-siRNA转染对MG63细胞的上调基因11（URG11）蛋白和mRNA表达的影响

2.2 URG11-siRNA对MG63细胞增殖的影响

与Control组相比，URG11-siRNA组的细胞在转染后2 d，细胞增殖开始明显下调（P＜0.05）；而NC-siRNA组的MG63细胞在转染1～4 d后，细胞的增殖活性与Control组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

表2 URG11-siRNA转染对MG63细胞增殖的影响（Mean±SD）

2.3 URG11-siRNA转染对MG63细胞凋亡和侵袭的影响

URG11-siRNA转染后，MG63细胞的凋亡率较Control组明显升高，说明URG11-siRNA转染明显增强了MG63细胞的凋亡（P＜0.05）。但是Control组与NC-siRNA组的MG63细胞的凋亡率的差异无统计学意义（P＞0.05）。（图2A和图2B）

URG11-siRNA组的穿膜细胞数明显少于Control组（P＜0.05），说明URG11-siRNA转染使MG63细胞的侵袭能力明显减弱。NC-siRNA组和Control组之间，穿膜细胞数的差异无统计学意义（P＞0.05），说明细胞的侵袭能力未明显改变。（图2C）

图2 URG11-siRNA转染对MG63细胞的侵袭和凋亡的影响

2.4 URG11-siRNA转染对MG63细胞内的Wnt/β-catenin信号通路的影响

与Control组相比，URG11-siRNA转染后，MG63细胞内的Wnt/β-catenin信号通路关键调控因子β-catenin及其下游靶基因c-Myc、Cyclin D1、MMP-2和Survivin的蛋白表达显著下调（均P＜0.05），而NC-siRNA组的MG63细胞内的β-catenin、c-Myc、Cyclin D1、MMP-2和Survivin的蛋白表达的变化无统计学意义（均P＞0.05）。（图3）

图3 Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的Western blot检测结果

3 讨论与结论

URG11基因位于人类11号染色体长臂，编码70 ku的URG11蛋白。作为乙肝病毒HBx蛋白的效应器，URG11能促进肝癌细胞从G1期进入S期，加快肝癌细胞的生长，促进肝癌的发展[4，6]。随着分子生物学研究的深入，多项研究结果表明，除了肝癌，URG11在其他肿瘤中的表达也存在上调。URG11在胰腺癌、乳腺癌中异常高表达，且与肿瘤浸润、转移和预后不良等临床病理现象相关[11]。研究者也在其他肿瘤中发现，高表达URG11可以促进肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移，并抑制肿瘤细胞凋亡，从而导致肿瘤的进展和转移[12-14]。研究结果显示，骨肉瘤组织中，URG11表达上调，且URG11的高表达与肿瘤的分期、增殖能力和预后有密切相关性[5]，而下调URG11能抑制细胞的恶性表型[9]。本研究结果显示，用siRNA干扰URG11表达可降低骨肉瘤MG63细胞的增殖、侵袭能力，并诱导细胞凋亡，这些结果与前人的研究结果一致，但URG11参与肿瘤细胞生物行为学调节的具体机制尚不明晰。

Wnt/β-catenin信号通路参与了机体内诸多生物学过程的调节。Wnt/β-catenin信号通路是细胞内进化上高度保守的Wnt通路的经典途径，β-catenin是该通路的关键因子。β-catenin在胞浆中过度表达可进入细胞核，促进一系列肿瘤靶基因的表达，包括Cyclin D1、c-Myc、转移相关基因MMP-2和Survivin等，从而影响肿瘤细胞的生长、迁移和凋亡等，与骨肉瘤等其他多种肿瘤的发生、发展密切相关[15]。研究结果显示，Wnt配体和受体在骨肉瘤中表达增加，而Wnt拮抗分子在骨肉瘤中表达减少，这表明Wnt通路的激活与骨肉瘤密切相关[10]。靶向Wnt/β-catenin信号通路，有可能成为骨肉瘤的一种治疗策略[16]。针对前列腺癌的研究结果显示，抑制Wnt/β-catenin信号通路活化，可以减弱URG11的致癌作用[13]。针对肝癌的研究结果显示，过度表达URG11可以促进Wnt/β-catenin信号通路关键因子β-catenin的转录，使β-catenin蛋白表达增加，从而促进肝癌细胞增殖[14]。为了探讨URG11在骨肉瘤细胞系中的致癌分子机制，本研究中进一步研究了干扰URG11表达后，骨肉瘤MG63细胞系中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白（β-catenin、c-Myc、Cyclin D1、MMP-2和Survivin）的表达情况。结果显示，采用siRNA干扰URG11表达后，β-catenin、c-Myc、Cyclin D1、MMP-2和Survivin蛋白表达显著降低，提示URG11在骨肉瘤细胞系中的致癌机制可能与调控Wnt/β-catenin信号通路有关。

综上所述，URG11在骨肉瘤发生、发展过程中发挥了重要作用，下调URG11表达，可抑制骨肉瘤MG63细胞增殖和侵袭，促进肿瘤细胞的凋亡，其分子机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化有关。因此，调节URG11的表达有可能成为骨肉瘤基因治疗的一个重要方向，但临床疗效和具体生物学机制，还有待更多的研究来证实。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突