电项针干预对急性脑出血大鼠Nrf2、NQO1表达和神经功能的影响∗

张晓辉 沈诗彦 柳依江 邵文娜 崔 海△

（1.首都医科大学，北京 100069；2.浙江省杭州市杭州种福堂中医医院，浙江 杭州 310011；3.山东中医药大学，山东 250000）

急性脑出血（ICH）属于中医学“中风病”范畴，占所有中风病的10%～15%，发病率和死亡率较高，存活率随着发病时间延长逐渐降低且存活者往往有重度残疾，给家庭和社会带来了沉重负担［1-2］。对于脑出血继发性脑损伤的病理机制，目前研究主要集中在脑出血后血脑屏障破坏、脑水肿、炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等方面［3］。脑出血后，体内积聚的自由基增多和清除自由基的能力下降使其氧化与抗氧化稳态失衡，造成了氧化应激损伤。核因子E2相关因子2（Nrf2）通路是调节氧化应激的重要通路［4］，可上调NAD（P）H醌氧化还原酶1（NQO1）和血红素加氧酶-1（HO-1）等抗氧化酶的表达，抑制氧化反应，达到神经保护作用［5］。本实验通过观察脑出血急性期大鼠脑组织中Nrf2、NQO1的表达情况来探讨电项针干预对脑出血继发性脑损伤的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物

24只SPF级雄性SD大鼠，体质量280～320 g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京）2016-0011，饲养环境温度为（23±2）℃，光照/黑暗周期为12 h/12 h，自由饮水、进食。

1.2 试剂与仪器

qPCR试剂盒（美国KAPA Biosystems），逆转录试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司）。BCA Protein As⁃say Kit（北京Cwbiotech公司），蛋白裂解液（中国优科卓业生物公司），Protein ladder（北京Biomed公司），SDS（美国Sigma公司），APS（美国Amresco公司），TRIZOL（美国Invitrogen公司），HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒（康为世纪，批号CW2582），HiFiScript cDNA Syn⁃thesis Kit（康为世纪，批号CW2569），兔抗Nrf2抗体（美国abcam公司，批号ab31163），兔抗NQO1抗体（美国abcam公司，批号ab34173），桌面数显脑立体定位仪（深圳RWD Life Science），华佗牌电子针疗仪（苏州医疗用品厂有限公司），高速冷冻离心机（Beckman公司），实时定量PCR仪（美国ABI）。

1.3 分组与造模

1）分组：实验动物随机分成4组，空白对照组、假手术组、ICH模型组和ICH电项针组，每组6只。2）模型制备：空白对照组不给予任何干预。采用自体血注入尾状核形成血肿，制备自体血脑出血模型［6］。大鼠称重后给予7 mL/kg 20%乌拉坦腹腔注射麻醉，头部备皮，将大鼠头部以俯卧位体位固定在脑立体定位仪上，消毒后沿正中线切开约1 cm，充分暴露前囟，根据大鼠脑定位图谱［7］确定右侧尾状核位置，在前囟右3 mm、后0.2 mm处用牙科钻钻开直径约1 mm的小孔，深度至硬脑膜但不伤及脑实质。尾静脉抽取约100 μL自体血备用，用微量注射器抽取50 μL自体血沿小孔匀速注入，深度约5.5 mm，速度为5 μL/min，注射完毕后原位留针10 min，缓慢退针，随即用骨蜡封闭，缝合头部皮肤并消毒。假手术组除不注入自体血外，其余操作同模型组。造模1 d后，行平衡木行走试验［8］对大鼠神经功能进行评分，评分大于1分可认为造模成功，予以纳入实验，否则剔除。

1.4 干预方法

ICH电项针组大鼠造模后第1天进行干预，根据《实验针灸学》［9］和《大鼠穴位图谱的研制》［10］确定供血（颈4夹脊穴）和风池位置。常规消毒后，选用0.35 mm×40 mm华佗牌不锈钢毫针针刺，进针深度约3 mm，连接华佗牌电子针疗仪，正极接风池，负极接供血，设置疏波，频率1 Hz，针刺时间15 min/次，每日1次，连续5 d。其他组均不干预。

1.5 检测指标

1.5.1 平衡木行走试验 造模1、3、5 d后采用平衡木行走试验对大鼠行为学进行评价［11］，选用长80 cm、宽2.5 cm的横木条作为测试装置。评分标准为6个等级。0分：能跳上平衡木，在上面行走不会跌倒；1分：能跳上平衡木，在上面行走跌倒机会小于50%；2分：能跳上平衡木，在上面行走跌倒机会大于50%；3分：在健侧后肢帮助下能跳上平衡木，但受累瘫痪侧后肢不能帮助向前移动；4分：在平衡木上不能行走，但可坐在上面；5分：将大鼠放在平衡木上会掉下来。

1.5.2 脑组织Nrf2、NQO1 mRNA测定 造模后第5日给予麻醉并断头取脑，保存于-80℃。选择血肿周围组织，取100 mg使用试剂盒提取样本总RNA。设计和合成引物见表1，反转录合成cDNA根据HiFiScript cD⁃NA第一链合成试剂盒（CW2582）的操作说明书，进行实时PCR反应，采用2-ΔΔCt值进行数据统计。

表1 目的基因引物序列

1.5.3 脑组织Nrf2、NQO1蛋白表达水平检测 按照RIPA试剂盒提取脑组织总蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量，将每孔30 μg蛋白样品上样量进行点样，10%SDS-PAGE电泳分离总蛋白，转膜至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭，加入适量一抗4℃孵育过夜，TBST清洗后，加入适量二抗室温孵育40 min。滴加ECL显色液显色，根据发光程度调整不同压片时间进行曝光拍片。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠平衡木行走试验评分比较

见表2。造模1 d后，假手术组与空白对照组相比无统计学意义（P>0.05），其余各组与假手术组相比评分均明显升高（P<0.01）。造模3、5 d后，与ICH模型组相比，ICH电项针组评分有下降趋势（P<0.01）。

表2 各组大鼠平衡木行走试验评分比较（分，±s）

表2 各组大鼠平衡木行走试验评分比较（分，±s）

注：与空白对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；与假手术组比较，∗P<0.05，∗∗P<0.01；与ICH模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01。下同。

组别空白对照组假手术组ICH模型组ICH电项针组n 6 6 6 6造模1 d后0.00 0.17±0.40 1.50±0.49##**1.17±0.40△△造模3 d后0.00 0.33±0.47 2.67±0.75##*1.33±0.47△△造模5 d后0.00 0.17±0.37 2.00±0.58##**0.67±0.47△△

2.2 各组大鼠脑组织Nrf2、NQO1 mRNA含量比较

见表3。与空白对照组相比，ICH模型组和ICH电项针组Nrf2、NQO1 mRNA表达量均有所上升（P<0.01）。ICH模型组与假手术组相比，Nrf2、NQO1mRNA表达量明显上升（P<0.01）。与ICH模型组相比，ICH电项针组的表达量升高（P<0.01或P<0.05）。

表3 各组大鼠脑组织Nrf2、NQO1 mRNA含量比较（±s）

表3 各组大鼠脑组织Nrf2、NQO1 mRNA含量比较（±s）

组别空白对照组假手术组ICH模型组ICH电项针组n 6 6 6 6 Nrf2 mRNA 0.56±0.14 0.68±0.09 1.76±0.17##**2.42±0.32△△NQO1 mRNA 0.43±0.11 0.60±0.08 1.84±0.25##**2.21±0.25△

2.3 各组大鼠脑组织Nrf2、NQO1蛋白表达水平比较

见表4，图1。与空白对照组相比，其余各组脑组织中Nrf2、NQO1蛋白表达量均上升（P<0.05或P<0.01）；与假手术组相比，ICH模型组蛋白表达量升高，差异具有统计学意义（P<0.01）。与ICH模型组相比，ICH电项针组蛋白表达明显升高（P<0.05或P<0.01）。

表4 各组大鼠脑组织Nrf2、NQO1蛋白表达水平比较（±s）

表4 各组大鼠脑组织Nrf2、NQO1蛋白表达水平比较（±s）

组别空白对照组假手术组ICH模型组ICH电项针组n 6 6 6 6 Nrf2蛋白0.22±0.06 0.27±0.06##0.36±0.07##**0.45±0.07△△NQO1蛋白0.15±0.10 0.22±0.06#0.29±0.13##**0.35±0.11△

图1 各组大鼠脑组织Nrf2、NQO1蛋白表达水平

3 讨论

中风病的基本病机是机体阴阳失调，气血逆乱，上犯于脑，导致脑脉痹阻或血溢脑脉之外，使神明失养，其病性是本虚标实［12］。临床表现以突然昏仆、不省人事、半身不遂、言语障碍为主要特征。

电项针是由高维滨教授依据多年临床经验创立的［13］，以风池、供血为主穴，其治疗机制一是兴奋脑干网状结构上行激活系统，活化大脑皮质神经元；二是促进椎-基底动脉系统血液循环，改善脑部血液循环、脑脊液循环来治疗脑颈项部疾病。本实验采用的供血、风池二穴，从解剖角度讲，浅层有枕动脉、枕静脉，深层有椎动脉，针刺项部腧穴并施加疏波脉冲电流刺激能够改善椎-基底动脉、颈内动脉血液、Willis环的血液循环，同时能够产生神经冲动，刺激中枢神经使受损的神经反射重新建立，进而达到改善ICH后大脑、小脑、脑干的各项功能。从中医理论讲，风池穴属足少阳胆经，是胆经与阳维脉交会之处，有清肝利胆、平肝潜阳之效；供血位于风池下1.5寸，平颈2、3椎间，有补血活血之效，广泛用于治疗脑缺血发作（椎-基底动脉系统）、吞咽困难、肌紧张性头痛、失眠、功能性震颤等症［14］，故针刺二穴可平肝熄风，醒脑开窍，促进血液循环和脑功能恢复。我们及同道研究均表明电项针能显著降低ICH大鼠脑组织AQP4蛋白和mRNA表达［15］，降低急性期脑组织精氨酸加压素的表达［16］，抑制脑水肿发生，减轻神经损伤。通过采用神经行为认知状态检查量表，比较治疗前后的定向能力、语言能力、记忆能力、计算能力评分及总分，说明电项针能减少ICH后神经功能损伤，改善患者认知功能障碍和运动功能缺损［17］，以上均说明电项针治疗ICH疾病临床疗效明确。

Nrf2通路发挥抗氧化作用是通过与抗氧化反应元件（ARE）结合［18］，启动下游基因转录来实现的。刘小江等［19］研究表明抑制MiR-27b的表达，激活Nrf2/ARE信号通路及下游靶蛋白HO-1、NQO1表达，可有效缓解高血压性ICH模型大鼠体内的氧化损伤和神经炎症，降低了神经细胞凋亡。张莉等［20］研究表明，抑制Fyn后Nrf2的蛋白表达明显升高，其下游因子HO-1和NQO1的表达也显著升高。本实验中，与假手术组相比，各组Nrf2、NQO1的表达均增高且差异具有统计学意义，电项针干预后Nrf2、NQO1 mRNA和蛋白的表达较模型组增高，说明电项针能够促进出血后Nrf2、NQO1的表达。通过比较平衡木行走试验评分，说明电项针干预对神经功能有改善作用。

综上，本实验表明电项针可以提高Nrf2、NQO1基因和蛋白的表达，调控氧化应激反应，减轻脑出血后继发性损伤，进而改善神经功能损伤，其机制可能是通过激活Nrf2信号通路来实现的，但具体机制还需进一步探究。