甲霜灵、多菌灵、烯酰吗啉在烟叶中的降解动态研究

张慎 肖新生 刘园 袁方 李佳颖

(1湖南省烟草公司永州市公司东安县分公司湖南永州425100;2湖南科技学院化学与生物工程学院湖南永州425199;3湖南省烟草公司永州市公司湖南永州425100)

烟草在田间生长过程中会受到各种病虫害的危害，病虫害得不到有效的防治，可能会严重影响烟草的品质和产量，甚至导致绝收。尽管有很多生物防治等新技术涌现，但是化学农药仍然是目前烟草病虫害防治的主要手段［1］。甲霜灵、多菌灵和烯酰吗啉都属于杀菌剂，被广泛用于水果、蔬菜、花卉等农作物的病虫害防治［2-4］，这3种农药在烟草中常出现超标现象；虽然这些农药药效高、毒性相对较低，但是其对哺乳动物等还是有一定的毒害作用［5-10］。杨丽芬等［11］用高效液相色谱法测定苹果中多菌灵和噻菌灵，比较SPE、QuEChERS两种前处理方法的准确度和精密度。卢娜等［12］建立了超高效液相色谱-串联质谱法测定八角中甲霜灵和抗蚜威残留量的方法。郭宏斌等［13］采用高效液相法同时测定草莓、西瓜、生菜、西红柿、荔枝和龙眼中烯酰吗啉和赤霉素的残留量。目前，关于甲霜灵、多菌灵和烯酰吗啉的残留检测和残留降解规律问题，国内外的文献报道较少。因此，理清这3种农药在烟草中的降解规律，对于指导烟农规范用药、合理用药及保证烘烤制品安全性具有重要的意义［14］。

本研究选取甲霜灵、多菌灵和烯酰吗啉这3种烟草中常用的农药为研究对象，在永州市烟叶生产技术中心试验田开展了为期两年的田间试验，分别喷施1、2和4倍推荐量农药于鲜烟叶和烤后烟叶中，考察其降解情况。为探索有效控制烟叶中农药残留的措施，采用液相色谱质谱联用法检测技术研究甲霜灵、多菌灵和烯酰吗啉在烟草上的农药残留特征，明确了3种农药残留水平与降解规律。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

甲霜灵标准品（纯度≥98.7%）、多菌灵标准品（纯度≥98.7%）、烯酰吗啉标准品（纯度≥98.7%）、丙甲草胺标准品（纯度≥98.7%），皆购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲霜灵（可湿性粉剂，有效成分含量为8%，浙江禾本科技有限公司）、多菌灵（可湿性粉剂，有效成分含量为50%，上海悦联化工有限公司）、烯酰吗啉（水分散粒剂，有效成分含量为80%，山东源丰生物科技有限公司）；N-丙基乙二胺（PSA，Agela Technologies公司）；无水MgSO4、NaCl、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠（均购自上海国药集团化学试剂有限公司，且均为分析纯）；乙酸乙酯（色谱纯，德国Merck公司）；正己烷（色谱纯，德国Merck公司）；乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；蒸馏水。

1.1.2 仪器设备

LC-MS 8030高效液相色谱质谱联用仪（日本岛津公司）；SQP万分之一电子天平（瑞士赛多利斯公司）；A-10 basic高速植物组织捣碎机（德国IKA公司）；GL-88B涡旋混匀器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；TG16G速离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；R-1001VN旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 农药在烟草中残留量与降解规律田间试验

田间试验于2019—2020年在湖南省烟草公司永州市公司烟叶生产技术中心进行，供试烟草品种为云烟87号，整个田间生产过程符合当地农业规范（GAP）生产要求。参照农业农村部《农药残留试验准则》和《农药登记残留田间试验标准操作规程》，动态试验按照1、2和4倍推荐剂量用药，施药2次，于旺长期-现蕾期叶背和叶面喷雾施药。每个小区面积30 m2，行距120 cm，株距50 cm。小区试验重复3次，随机排列，设置小区保护带与对照小区。烟株现蕾后期，叶面均匀喷雾施药。1倍推荐剂量甲霜灵、多菌灵、烯酰吗啉的有效成分用量分别为118.5、444.4、355.6 g a.i./hm2，用水量887.7 L/hm2。间隔一个星期后，第二次施药。于第二次施药后2 h和1、3、5、7、14 d采样，将样品去主脉、切碎、混匀，用四分法留样不少于200 g，于-20℃环境保存，待检测。

1.2.2 烟叶烘烤前后及不同采收间隔期最终残留量田间试验。

于最后一次施药后7、14、21 d，采用半叶法研究烘烤前后农药残留量的降解变化：随机采集烟叶样品100片，用半叶法称重编杆后，采用三段式烘烤工艺进行烘烤处理；将烟叶去主脉并粉碎，缩分后留样100 g，于-20℃环境保存，待检测。

1.2.3 残留检测

1.2.3.1 农药残留前处理方法

参照标准《YC/T 405.1—2011烟草及烟草制品多种农药残留量的测定第1部分：高效液相色谱-串联质谱法》进行适当修改。修改之处为：改用异丙甲草胺（5μg/mL）作为内标进行定量分析。

1.2.3.2 农药残留检测条件

（1）LC-MS/MS色谱条件：色谱柱AQ-C18 HP（3.0μm，2.1×100 mm）；流动相为乙腈和水（V/V）；流速：0.3 mL/min；采用“15∶85（V/V，0～2.5 min）→50∶50（V/V，2.5～14 min）→95∶5（V/V，14～16 min）→15∶85（V/V，16～18 min）”进行梯度洗脱；柱温25℃；进样量5μL。

（2）质谱条件离子源：电喷雾离子源ESI；扫描方式：正离子源；喷雾电压：3 000 V；毛细管温度：300℃；鞘气压力：50 Arb；辅助气压力：20 Arb；检测方式：多重反应监测（MRM，具体条件见表1），典型的色谱图见图1。

表1 三种农药的MRM条件

图1 甲霜灵、多菌灵、烯酰吗啉和异丙甲草胺典型TIC色谱图

1.2.3.3 标准曲线与添加回收率

分别配置浓度为100 mg/L的甲霜灵、多菌灵和烯酰吗啉标准溶液；再用烟叶空白提取液稀释，配得农药浓度为0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5 mg/L的含内标异丙甲草胺（0.05 mg/L）的基质加标系列标准溶液，绘制标准曲线；分别往空白烟叶提取液中添加不同浓度（0.1、0.5、2 mg/kg）的甲霜灵、多菌灵和烯酰吗啉标准溶液，进行添加回收率检测验证。

2 结果与分析

2.1 标准曲线、检出限与添加回收率

在0.005～5 mg/kg，3种农药跟内标的峰面积比与农药质量浓度呈良好的线性关系。以3倍信噪比进行计算，得出甲霜灵、多菌灵和烯酰吗啉的最低检出限均为1.0×10-11g，同时根据最小的添加水平得到3种农药的定量限（LOQ）为0.01～0.02 mg/kg（表2）。甲霜灵、多菌灵和烯酰吗啉在0.1、0.5、2 mg/kg的添加回收率分别为81.2%～98.5%、83.1%～101.5%、85.1%～101.5%，相对标准偏差分别为2.2%～5.4%、2.9%～7.5%、3.5%～7.8%。添加回收率结果均符合残留检测方法要求，可用于烟叶中3种农药的残留检测。

表2 甲霜灵、多菌灵和烯酰吗啉在烟叶中的线性方程、相关系数与定量限

2.2 烟草鲜烟叶中甲霜灵、多菌灵、烯酰吗啉消解规律

甲霜灵在鲜烟叶中的残留量实验结果（图2）表明，施药的第一天农药含量普遍都很高，且农药浓度越高残留越大。第二次施药2 h后，1、2和4倍推荐施药量的烟叶中甲霜灵沉积量分别为7.1、18.7、36.6 mg/kg。甲霜灵在鲜烟叶中的农药残留量随着施药间隔期的延长整体呈下降趋势（图2-a），且降解速率先快后慢，14 d后残留量分别降为0.1、2.4、5.3 mg/kg，14 d时，消解率均超过85%。7 d之后，1、2倍农药残留量变化均渐趋平缓。至14 d时，虽还未降解完全，但残留量已经较低。

图2 鲜烟叶中甲霜灵（a）、多菌灵（b）、烯酰吗啉（c）的残留量随施药时间变化的曲线

多菌灵在鲜烟叶中的残留量实验结果表明，第二次施药2 h后，1、2和4倍推荐施药量的烟叶中多菌灵沉积量分别为13.3、23.8、34.9 mg/kg（图2-b）。14 d后多菌灵残留量分别降为2.3、4.0、8.2 mg/kg，消解率均超过75%，消解速度比甲霜灵要慢。

烯酰吗啉在鲜烟叶中的残留量实验结果表明，施药第一天农药烯酰吗啉残留量最大（图2-c）。第二次施药2 h后，1、2和4倍推荐施药量的烟叶中烯酰吗啉沉积量分别为21.0、38.6、47.1 mg/kg。烯酰吗啉在鲜烟叶中的农药残留量随着施药间隔期的延长整体呈下降趋势，7 d后1、2和4倍农药残留量已趋近于平缓，14 d后残留量分别降为1.7、2.8、5.1 mg/kg。施药3 d后消解率均超过50%；14 d时，消解率均超过89%。

采用Excel进行线性回归分析，按照指数方程进行拟合，得到了鲜烟叶中农药残留消解动态方程及半衰期，详见表3。甲霜灵、多菌灵和烯酰吗啉在鲜烟叶中的残留消解动态方程均符合一级动力学方程，甲霜灵和多菌灵趋势线拟合程度的指标R2值在0.867 1～0.984 3，而烯酰吗啉趋势线拟合程度的指标R2值在0.743 6～0.781 9。不同施药量的半衰期，甲霜灵为2～4 d，多菌灵为5～6 d，烯酰吗啉为3～4 d。比较而言，多菌灵的降解速率要慢一些，甲霜灵和烯酰吗啉的降解速度差不多。

表3 鲜烟叶中农药残留消解动态方程及半衰期

2.3 烟叶烘烤过程中甲霜灵、多菌灵和烯酰吗啉加工因子

为了解烟叶烤制过程中农药的消解情况，对第二次施药后7、14、21 d采收的烟叶烤制前后农药残留量进行了对比分析，发现甲霜灵、多菌灵和烯酰吗啉的加工因子分别在0.42～0.65、0.41～0.64和0.50～0.64，详见表4。烟叶烘烤中的高温过程，会促使部分农药分解，同时烘烤过程中的高温条件使微生物彻底失活，降低了烟叶中水分的含量，导致后期的农药降解缓慢。

表4 烟叶烘烤过程中甲霜灵、多菌灵与烯酰吗啉加工因子

2.4 烤后烟叶中甲霜灵、多菌灵与烯酰吗啉消解规律

烤后烟叶在存放过程中，农药会逐渐分解而使残留量下降，残留量下降速度与烟草农药残留安全性有较大关系。为更好地判断不同存放期烟叶中农药残留情况，分别采摘第二次喷药后第7、14、21天的烟叶，经烤制、切丝混匀后，避光放置在25℃、60%的恒温恒湿箱中。在烤后的第0、30、60天分别取样测定烟叶中甲霜灵、多菌灵、烯酰吗啉的降解情况，结果如图3-a、3-b和3-c所示，残留限量值均为2 mg/kg。从图3-a中可以看出，只有第7天收获的4倍农药用量烤后0 d烟叶中甲霜灵含量超过烟草行业标准［15］中规定的残留限量；烤后14 d，残留量下降，其含量低于残留限量值。从图3-b可看出，不管是多少天的采收间隔期，4倍多菌灵用药量的烟叶中残留量均超过限量值，而对于1倍和2倍的用药量，只有第7天收获的2倍用药量的烟叶中多菌灵残留量高于限量值，其他均未超限。从图3-c可看出，第7天收获的4倍用药量烤后烟叶中烯酰吗啉的含量均超过残留限量，而且第14天收获的4倍用药量烤后30 d烟叶中烯酰吗啉的含量也大于2 mg/kg。

对含量变化曲线进行拟合，得到各个样品的半衰期，如表5所示。无论是甲霜灵、多菌灵还是烯酰吗啉，低浓度施药量的样品半衰期相对较短，最短的为102 d，最长的为211 d。

表5 烤后烟叶农药残留消解半衰期

图3 烤后干烟叶中甲霜灵（a）、多菌灵（b）、烯酰吗啉（c）残留量随烤后时间的变化情况

3 讨论与结论

本研究是对云烟87号中甲霜灵、多菌灵、烯酰吗啉3种农药的残留量变化情况进行考查，发现其鲜叶中农药消解均与一级动力学方程相符。在收获前期，农药降解速度较快，后期逐渐变缓慢；到收获后期，残留量降至较低水平并趋于稳定。在鲜烟叶中，喷洒农药7 d后，农药残留量基本上已趋于平缓的状态，在14 d后消解率超过85%。农药残留量与使用剂量呈正相关，同收获间隔期呈负相关。收获间隔期对烟叶中农药残留量的影响显著高于施药剂量的影响。

根据烤后烟叶的农药残留情况、加工因子和鲜叶中农残降解动态方程，结合烟农施药习惯，对各个安全系数进行分析，推导出施药到采摘的安全间隔期。从烤后烟叶农药残留和施药习惯看，3种农药的施药量不得超过推荐施药量的2倍，因此接下来将基于2倍量施药量进行探讨。施药量为2倍时，甲霜灵、多菌灵、烯酰吗啉的加工因子分别为0.59、0.64和0.69（7、14、21 d采样加工因子的最高值），根据回收率测定误差分别为18.8%、16.9%、14.9%。按最终残留量不超过2 mg/kg，折合误差和加工因子，计算得采摘时鲜烟叶甲霜灵、多菌灵、烯酰吗啉残留量最小分别为2.63、2.67、2.52 mg/kg。按2倍量施药动态消解方程计算，甲霜灵、多菌灵、烯酰吗啉的收获间隔期t值分别为8.7、15.6、11.5 d。合理使用建议：8%甲霜灵可湿性粉剂按照推荐剂量118～236 g a.i./hm2，50%多菌灵可湿性粉剂按照推荐剂量444～888 g a.i./hm2，80%甲霜灵可湿性粉剂按照推荐剂量355～710 g a.i./hm2，均施药2次，施药间隔7 d；甲霜灵最后一次施药距收获间隔期为9 d，多菌灵最后一次施药距收获间隔期为16 d，烯酰吗啉最后一次施药距收获间隔期为12 d。