酱油中风味物质形成的研究进展

陈 杰，赵 莹，何一龙，刘晓艳，白卫东，钱 敏，赵文红

（1.广东粤师傅调味食品有限公司，广东开平 529341；2.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州 510225；3.现代农业工程创新研究院，广东广州 510225）

酱油俗称豉油，主要以大豆、饼粕等为原材料，辅以小麦、面粉或麦麸等，经微生物发酵得到的液态调味品，距今已有3 000多年的历史[1-3]。低盐固态型、淋浇型、高盐稀态型和传统发酵型是酿造酱油中常见的四类，低盐固态型发酵时间短、酱香浓、色泽深且价格低，淋浇型色泽光亮，高盐稀态型香气种类较多且风味较好，而传统发酵型具有独特且不可复制的风味[4]。传统发酵型酱油的发酵周期长，生产效率不高，且发酵过程中自然污染难以控制，这对产品的质量和安全构成了较大的威胁。因此，在工业化生产的前提下，酿造酱油的传统式发酵逐渐被高盐稀态式发酵所取代，但高盐稀态式发酵罐的罐体较为封闭，得到的酱油风味不足，原因在于传统发酵方式的发酵制剂很难被复制[5]。以酱油的挥发性风味物质、滋味物质及微生物对风味物质的影响为中心，近年来国内外学者对酱油中挥发性风味物质、滋味物质及微生物的种类、数量和检测手段的报道进行归纳，总结了酱油风味形成的机理及其与微生物的关系研究，力求为后续酱油风味的研究提供理论依据。

1 酱油的挥发性风味物质

1.1 挥发性风味物质

挥发性风味物质在酱油中以醇、酸、酚、酯、醛、酮、含硫含氮和呋喃类为主。这些物质共同给予酱油特征性。

酱油中的醇类来自原料成分的降解或产生于发酵过程，主要为苯乙醇和乙醇。苯乙醇带有玫瑰样香气，乙醇自身的香气强度较弱，一般作为香气物质的合成底物，间接对酱油的香气提供作用。在生抽与老抽的对比中，生抽的乙醇含量较高[6]。在日式酱油中，高级醇类物质的含量较高，而广式酱油中高级醇种类更加丰富，并且含有较多的脂肪醇[7]。醇类物质往往使人产生愉悦感并且间接地影响着酱油的风味，如带有玫瑰样香气的苯乙醇和在酱油中扮演香味物质合成底物角色的乙醇[8]。乳酸菌的发酵作用是酱油中酸类物质的主要来源，酸类物质呈味的同时可与醇反应形成酯，形成酱油中特有的酯香。具有烟熏风味的酚类物质，能够为酱油提供烘烤香气，烘托点缀酱香，其中主要包括麦芽酚（Maltol）、愈创木酚（Guaiacol）、4-乙烯基愈创木酚（4-Vinylguaiacol）、4-乙基愈创木酚（2-Methoxy-4-ethylphenol）等成分，由原料中的木质素、糖类等为前体经霉菌、酵母菌的发酵生成[9]。酯类物质因其自身的甜香和果香味成为了酱油独特的主体风味，并且能够调和咸味。

酱油的酿造过程体系复杂，由氨基酸代谢和油脂氧化代谢能够同时产生醛类物质和酮类物质，前者本身不呈味，但能够与其他物质作用并生成特殊香气成分[7]，后者具有的花香和果香味能够赋予酱油醇厚的酱香风味[10]。含硫氨基酸和硫胺素代谢产生的含硫类化合物低含量时就能够显现其独特的呈味特性。赵国忠等人[11]对比沪酿3.042与100-8这2种米曲霉发酵的酱油，其中米曲霉100-8变化最明显的是吡嗪类物质的增多。该类化合物主要是由美拉德反应生成的含氮化合物，其香气特征可随浓度含量变化，低浓度时，具有豌豆、坚果、水果、胡椒、花生等香味[12]，能够赋予酱油独特的焙烤和坚果风味[13]。呋喃（酮）类是酱油中香气贡献较大的一类，可由鲁式接合酵母产生。高献礼等人[14]使用3种萃取方法分离鉴定酱油的挥发性风味物质，发现大部分呋喃和呋喃酮均在直接溶剂萃取法中被检出。特别是其中的4-羟基-2（5）-乙基-5（2）-甲基-3（2H）-呋喃酮（HEMF）具有减弱咸味、增强甜味的效果，给酱油带来焦糖香气[15]。

1.2 挥发性风味物质的检测方法

已发现的酱油香气成分超过1 000种，其种类繁多，较为复杂。挑选适当的前处理方式，对揭示酱油风味组成的真实性和准确性至关重要，并且挥发性风味物质在较为单独的前处理条件下难以得到充分的萃取，通常都是结合不同的萃取方法，对酱油的香气成分进行前处理。

风味物质提取方法的优缺点见表1[16-21]。

挥发性风味物质的检测第一步是对样品进行提取处理，第二步是对提取物中的成分进行分析（定性、定量），目前常用的香气物质检测技术有气相色谱法（GC）、液相色谱法（HPLC）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）、气相色谱嗅闻技术和电子鼻检测技术（GC-O）、全二维气相色谱与飞行时间质谱联用（GC×GC-TOF MS）等。其中，GC-MS法具有灵敏度高、分离效果好、鉴定能力强等特点，被广泛运用于酱油风味物质的研究中。

表1 风味物质提取方法的优缺点

2 酱油的滋味物质

2.1 滋味物质

咸、甜、酸、鲜、苦五味共同组成了酱油独有的滋味[22]。其中，氨基酸和有机酸是酱油中重要的滋味物质。

根据呈味特点的不同，酱油中的氨基酸被分为3类，即苦、甜与鲜味。近年来，对其的研究主要运用于酱油品质的评价、呈味特性的研究和种类的区分[23-25]。有学者运用全自动茚三酮显色法对不同种类酱油中的8种游离氨基酸进行了检测，发现酱油的风味是由各种游离氨基酸分子共同影响的结果，并不是由谷氨酸单纯提供[26]。还有学者对比了中式与日式酱油非挥发性风味物质的区别，发现中式酱油中的鲜味氨基酸含量显著高于日式酱油，然而日式酱油中的甜味和苦味氨基酸均高于中式酱油[27]。

乳酸、乙酸、丁二酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、焦谷氨酸与草酸等20多种有机酸是酱油中酸味的主要来源[28]。酱油的品质受有机酸种类与含量的影响，适量的有机酸可以对风味有重要的影响，其本身具有的酸味和特殊口感，可以独自形成香气，与醇类物质酯化成酯可以增强酯香，但酸含量过高或分布不平衡会使酱油的口感粗糙且刺激不协调。张露等人[29]测定了3款酱油中的10种有机酸，结果显示乳酸和乙酸之和占总有机酸质量分数的35%以上，因此认为酱油中主要的有机酸为乳酸和乙酸，并且特级酱油中有机酸种类和总含量均高于三级酱油。张怡洁[22]测定了12种不同地区酱油中的有机酸，发现乳酸和乙酸是酱油中的主要有机酸、琥珀酸和苹果酸在酱油中少量存在，并且发现酱油中几乎不含丙酸。

2.2 滋味物质的检测方法

2.2.1 氨基酸的检测方法

大部分氨基酸没有荧光基团或紫外吸收的小分子物质，因此其检测方法相对较复杂，直接检测法、柱前衍生法与柱后衍生法是氨基酸检测中常用到的3种方法。

氨基酸的直接检测方法中高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法（HPAEC-IPAD）和高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD）较为常见[30]。HPAEC-IPAD法的原理是，在一定pH值条件下，氨基酸分子中的氨基和部分羟基发生氧化反应引起微弱电流变化而被检测[31]。ELSD是一种常用的检测器，具有高通用性、使用简单的特点，结合HPLC使用往往不用考虑样品的光学性质和物质本身的结构，即使被测物质无紫外吸收或荧光基团也无太大影响，但缺点是其灵敏性不高，不适用于进行定量分析[32]。直接检测法具有操作简便、无需衍生等优点，但也存在一些局限性，且所使用的仪器设备一般实验室不配备，不是常用的氨基酸检测方法。

柱前衍生法在运用HPLC法和GC法检测酱油中的氨基酸时往往被用到，一般结合UV或FLD使用。这2种方法都具有检出限低、灵敏度高的特点。但由于需要进行柱前衍生，各种衍生化试剂的差异性会导致其在对氨基酸的检测中具有一定局限性。有学者提出了RP-HPLC法、C-GC法（毛细管气相色谱法）等经过优化后的氨基酸检测方法，同时结合相适宜的衍生试剂，以减少柱前衍生法的局限性[33]。柱后衍生法是指先将氨基酸进行色谱柱分离，再对其进行衍生处理最后检测。相比较于柱前衍生，柱后衍生法的可重复性更高，除特定分离柱之外，还需要泵和反应器使洗脱液和衍生试剂混合均匀。氨基酸自动分析仪就是根据该方法原理研发得来的。氨基酸的自动分析仪所需样品衍生化时间短、衍生条件对检测结果精确度影响较小，而且还具有样本的耐受性较高、所需的样品量较少的特点。由于衍生化试剂并没有直接注入到色谱柱内部。因此，该法中色谱柱的使用寿命能够得到有效的延长[34]。

2.2.2 有机酸的检测方法

酱油中有机酸的检测方法相对氨基酸的较单一，主要有GC法、HPLC法和IC（离子色谱）法。其中，酱油中有机酸的检测HPLC法的使用频率较高。

有机酸属于极性小分子弱酸，易溶于水，在水系流动相中以离子形式存在而不能在非极性的键合相色谱柱固定相上保留。有机酸的离解常数不是很大（pKa＞2），在pH值2～3时，有机酸的解离反应向逆反应方向进行，解离受到抑制[35]。

3 酱油的相关微生物

3.1 微生物的种类

酱油是利用微生物丰富的酶系作用于原料得到的发酵产品。发酵过程中的微生物除了自身可代谢生成不同的代谢产物，还可通过自溶作用释放出许多营养物质，这些物质经过复杂的生物化学反应过程，最终影响酱油风味的形成。米曲霉是酱油酿造中使用最广泛的一种微生物，能够分泌许多种酶类分解酱油原料[36]。其中，蛋白水解酶可作用于肽键，将蛋白质水解为小分子肽链和氨基酸；糖化酶可将糊化后的淀粉类原料转换成麦芽糖或葡萄糖。另外，菌体自溶后，谷氨酰胺酶可催化降解谷氨酰胺，将其水解成谷氨酸。黑曲霉多与米曲霉混合制曲发酵酱油，黑曲霉所含的植物组织溶解酶（纤维素酶、果胶酶）能破坏植物细胞壁，使胞内蛋白质和淀粉暴露出来，然后与米曲霉的蛋白酶共同作用，使暴露出来的胞内蛋白和淀粉得到充分降解[37]。

鲁氏酵母耐渗透压能力强，可在高盐高糖环境下生长，是一种主发酵酵母，在发酵前期加入，可产生乙醇、高级醇及芳香杂醇类物质，还能转化糖类物质生成多元醇（如甘油）及糖醇类风味物质[38-39]。此外，也产生呋喃酮类物质、琥珀酸等有机酸[40]。在发酵中后期，酱醪糖浓度与pH值均降低，鲁式酵母开始自溶，此时球拟酵母代谢活跃，参与酱醪成熟及风味物质的生成，将前期生成的醇类物质和有机酸等合成酯类物质，提升了酱油的呈香水平[41]。在酱油酿造环境中，球拟酵母可直接从酿造原料获得营养源，不需要特别添加营养源[42]。球拟酵母可代谢产生酚类化合物（如4-乙基愈创木酚、乙基酚等），同一时期，球拟酵母生成的酸性蛋白酶也可对短肽进一步水解，给酱油提香增鲜[43]。在发酵中后期，同样活跃的假丝酵母（Candida versatilis），可将炒小麦在微生物作用下生成的阿魏酸和香豆酸转换成4-乙基愈创木酚和4-乙基酚[37]。乳酸菌是一类能代谢各种糖类物质产生乳酸的细菌总称[42]，其中主要起作用的是嗜盐片球菌属（Pediococcus halophilus)、四链球菌（Tetracoccus）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）等，乳酸菌可与耐盐酵母在厌氧条件下发酵，消耗剩余的糖和氨基酸，增添酱油的风味。酱油发酵初期产生的乳酸会对酵母菌产生拮抗作用。后期成熟阶段，酱醪中乳酸的积累会导致pH值降低，这使得乳酸菌的生长受到抑制，但在酸性环境下酵母菌却能够生长繁殖并且进行酒精发酵，给酱油增添了柔和的酸味和香气[44]。

3.2 微生物与风味物质的关系

制曲微生物能够代谢产生丰富酶系，同时也为香气成分的产生提供前体物质，对酱油风味的产生具有显著影响[45]。许多研究表明，混菌制曲发酵的酱油风味更佳。近年来，较多学者的研究方向偏向于研究菌株特性、菌种间的相互作用及通过微生物有目的性地提高某类香气物质等。

Zhong Y等人[46]研究2株米曲霉的基因组和转录体，发现一株发酵性能下降的米曲霉能有效地利用葡萄糖，燃烧多余的氨基酸，为菌丝体生长提供糖酵解和TCA循环的燃料，从而成为生存竞争中的优势菌株；另一株工业菌株则为了提高水解酶的产量而牺牲菌丝体的生长，促进风味前体物质形成的代谢途径，使其成为有利于曲发酵的菌株。

赵谋明等人[47]对5株高盐稀态酱油中具有代表性菌株进行理化性质分析，并探究其与酵母相互作用对菌株繁殖及风味形成的影响。研究发现，克氏库克菌的单菌与混菌培养体系都具有较好的风味特性，提升了乙酸、乙酸乙酯、苯乙醛、3-甲硫基丙醛和3-甲硫基-1-丙醇等香气物质。赵国忠等人[11]对比普通酿造酱油与添加植物乳杆菌酿造酱油的无盐固形物含量区别，发现添加植物乳杆菌的酱油有助于淀粉质原料向氨基酸、多肽类物质的转化而对糖类没有太大影响。Harada R等人[48]运用乙醇替代酵母、乳酸和乙酸替代乳酸菌的影响，研究了微生物及其产物对酱油香气影响发现，添加乙醇与添加酵母菌发酵的酱油风味差异明显，说明酱油香气成分并非乙醇转化，而是通过酵母代谢产生，在乳酸和乙酸替代乳酸菌的试验中，风味没有出现显著的变化，说明乳酸菌所产生的作用主要来自乳酸和乙酸。

张丽杰等人[49]筛选出可合成多种吡嗪化合物的枯草芽孢杆菌Nr.5，并基于此菌株研究提升酱油中吡嗪化合物种类及质量浓度的方法，对比发现只添加枯草芽孢杆菌Nr.5的酱油样品中只有2,5-二甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪的浓度有增加。而同时添加枯草芽孢杆菌Nr.5与发酵底物L-苏氨酸及D-葡萄糖的样品中，有7种吡嗪的浓度得到提升且总浓度提高了12.5倍。

4 结语

酱油风味主要分为挥发性与非挥发性（滋味）2种，挥发性风味物质往往能给消费者带来直观的第一感觉，滋味物质则是判断酱油风味好坏的最后关键因素，同时其也间接影响着挥发性风味物质的存在。酱油风味的影响因素主要有原料、生产工艺及微生物的菌种和数量，其中微生物菌种和数量最为关键。迄今为止，酱油发酵过程中能够产生作用的微生物对应的某种或某几种风味物质（挥发性和非挥发性）尚不完全明确，单独使用前体物如乳酸、乙酸和乙醇进行发酵对比添加产生乳酸、乙酸或乙醇的微生物发酵，将有助于进一步分析微生物参与每种挥发性风味物质的产生。因此，在今后酱油风味的研究中，不但要着重对微生物的特性进行研究，在风味提取的技术上也需多做对比，如在挥发性风味物质的提取上，几种方法各具优缺点，可适当结合一两种提取方法对酱油的风味进行检测。