中国传统发酵酱油中大豆异黄酮和大豆皂苷质量浓度测定及抗高血压功能

钟 宝，罗兴力

（1.吉林农业科技学院，吉林 吉林 132101；2.韩国全北国立大学，韩国 全州全北 54896）

0 引言

酱油（Soy sauce）是以大豆为原料制作的一种发酵食品，在中国已经有近2 500年的历史，在东亚的中国、韩国、日本作为一种调味料经常食用[1]。李红民等人[2]对酱油中大豆异黄酮含量进行了测定，结果证明经过发酵酱油中的大豆异黄酮含量明显增加。田晶等人[3]优化了酱油中皂苷的提取工艺，并测定了皂苷的含量。大豆及大豆发酵食品含有丰富的大豆异黄酮、皂苷等生物活性成分，这些成分对机体脂质的积累和高血压都有积极的调节作用。冯晓凡等人[4]研究表明，大豆异黄酮对肥胖大鼠的总胆固醇、甘油三脂和瘦素水平具有积极的调节作用。马增春[5]研究表明，大豆异黄酮对高血压造成的内皮损伤具有改善功效。罗舒蕾等人[6]研究表明，大豆异黄酮和大豆皂苷对心血管疾病具有调节作用。句连云[7]进行了大豆提取复合物对脂质代谢研究，结果具有积极调节作用。酱油本身也对高血压具有调节作用。Mun E G等人[8]的研究表明，韩国传统发酵酱油可以显著改善大鼠因高盐饮食诱发的高血压。酱油在我国是日常生活中的重要调料，2015—2018年我国酱油产量出现下降趋势，2019年产量开始上升。因此，酱油中有效成分的测定对新型酱油的开发和刺激酱油市场具有积极作用。目前，我国关于酱油的成分及功效研究报道相对较少，酱油中大豆异黄酮和大豆皂苷含量的测定，对酱油的功效研究将起到重要的作用。

2015—2019年中国酱油产量（数据来源：国家统计局）见图1。

图1 2015—2019年中国酱油产量

1 材料与方法

1.1 材料与设备

豆粕、小麦粉、米曲霉，均为市售；大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素标准品、齐果墩酸标准品、香草醛乙醇、硫酸、甲醇，均为分析纯。

Lamda 950 UV/Vis/NIR型紫外-可见-近红外红外光谱仪，美国Perkin Elmer产品；Ultimate3000型高效液相色谱仪，赛默飞世尔产品；KH-3200B型超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司产品；R-1001N型旋转蒸发仪，郑州长城科工贸有限公司产品；HH-S4型数显恒温水浴锅，济南欧莱博电子商务有限公司产品；索氏提取器；蒸馏水。

1.2 试验方法

1.2.1 酱油制备

（1）工艺流程。豆粕→浸润→蒸制→晾凉→混合（小麦粉、米曲霉）→酱油曲→盐水→发酵→淋油→过滤→杀菌→成品。

（2）操作要点。采用高盐稀态发酵法制备酱油。豆粕放入水中浸润5 h，于121℃条件下蒸制10 min，趁热与生面粉拌和，比例为8∶2，凉至40℃，接种曲精（米曲霉）接种量为0.3%，在30℃条件下发酵2～3 d（每隔6 h翻拌1次，防止温度过高），获得酱油曲，取酱油曲加入体积2.5倍的盐水，先后于45℃和30℃条件下分别发酵30 d，再经淋油、过滤、杀菌获得成品酱油，放入-20℃冰箱中保存待用。

1.2.2 酱油中大豆异黄酮测定

（1）标准品制备。分别精密称取大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素标准品适量，加入甲醇，配成0.2 mg/mL的储备液，作为对照溶液待用。

（2）大豆异黄酮提取[9-10]。取酱油5 mL，加入5 mL甲醇，超声处理30 min，以转速4 000 r/min离心15 min，取上清液，经0.45μm微孔膜过滤，装入HPLC分析瓶待用。

（3）色谱柱：YMC-Pack型，ODS，250 mm×4.6 mm×5μm；流动相A：0.1%醋酸水溶液；流动相B：0.1%醋酸乙腈溶液。采用线性梯度洗脱，洗脱程序为0～25 min，用5-80%B洗脱；25～35 min用80%B洗脱；35～45 min用80-5%B洗脱，体积流量0.8 mL/min，进样量20μL，检测波长260 nm。

1.2.3 酱油中大豆皂苷测定

（1）标准曲线绘制。精密量取1.0 mg/mL的对照品齐果墩酸溶液20，40，60，80，100，120μL分别置于试管中挥干，精密加入8%香草醛乙醇溶液0.5 mL，72%硫酸5 mL，摇匀；置于60℃恒温水浴中加热10 min，取出试管置冰水浴中冷却15 min，以溶剂甲醇同法操作制备空白溶液，于波长540 nm处读取吸光度，绘制标准曲线。

（2）样品含量测定[11-12]。取适量样品放入试管中挥杆，准确称取酱油试样1.000 0 g，用滤纸包好放入索氏提取器中，先用乙醚脱脂2 h。取出滤纸筒晾干，再放回索氏提取器中用甲醇提取6 h。提取液减压蒸干，蒸干物加水溶解，并在50 mL容量瓶中定容，准确移取此溶液10 mL于分液漏斗中，用经水饱和的正丁醇分4次提取，第1次用15 mL，第2，3，4次各用10 mL。有机相采用20 mL经正丁醇饱和的水洗涤后，加热蒸发至正丁醇彻底干燥。残渣加甲醇溶解，在10 mL容量瓶中定容，于波长540 nm处读取吸光度，计算含量。

2 结果与分析

2.1 大豆异黄酮含量测定

2.2.1 大豆异黄酮标准品的HPLC色谱图

4种大豆异黄酮的结构见图2，大豆异黄酮标准品HPLC色谱图见图3。

图2 4种大豆异黄酮的结构

图3 大豆异黄酮标准品HPLC色谱图

依据标准品的保留时间得到大豆异黄酮标准品的HPLC色谱图。其中，大豆苷保留时间为10.183 min，相对峰面积为18.76%，相对峰高为25.51%，标准品质量浓度为0.901 0 mg/mL；染料木苷的保留时间为11.605 min，相对峰面积为21.97%，相对峰高为20.97%，质量浓度为0.772 1 mg/mL；大豆苷元的保留时间为14.593 min，相对峰面积为18.72%，相对峰高为18.55%，质量浓度为0.617 5 mg/mL；染料木素的保留时间为16.677 min，相对峰面积为37.88%，相对峰高为33.35%，质量浓度为0.848 5 mg/mL。

2.2.2 样品中大豆异黄酮含量测定

以标准品为对照，对待测酱油样品进行HPLC分析。

酱油中大豆异黄酮含量HPLC色谱图见图4。

图4 酱油中大豆异黄酮含量HPLC色谱图

根据相对峰面积和相对峰高，计算样品中4种大豆异黄酮的含量。

酱油中大豆异黄酮含量测定结果见表1。

表1 酱油中大豆异黄酮含量测定结果

酱油样品中，大豆苷保留时间为10.143 min，相对峰面积为2.46%，相对峰高为1.68%，质量浓度为0.035 4 mg/mL；染料木苷保留时间为11.623 min，相对峰面积为0.05%，相对峰高为0.05%，质量浓度为0.000 5 mg/mL；大豆苷元保留时间为14.605 min，相对峰面积为0.67%，相对峰高为0.58%，质量浓度为0.006 6 mg/mL；染料木素保留时间为16.688 min，相对峰面积为0.09%，相对峰高为0.10%，质量浓度为0.000 6 mg/mL。

2.3 大豆皂苷质量浓度测定

以大豆皂苷的苷元类似物齐墩果酸作为标准品,绘制标准曲线，回归方程为Y=1.000 693×10-2X+9.710 601×10-8，相关系数R2=0.998 9，样品测定经过3次重复试验，测定中国传统发酵酱油中大豆皂苷质量浓度为8.942 4 mg/mL。

大豆皂苷标准曲线见图5。

图5 大豆皂苷标准曲线

3 结论

酱油是以大豆为原料制作的发酵调味料，很大程度上保留了大豆的功效成分，同时经过发酵工艺产生的次生代谢产物，包括异黄酮、大豆皂苷等[13]。天然的大豆异黄酮通常与糖结合，会影响在人体肠道内的吸收，使其利用率下降，而大豆发酵食品可以增加糖苷中异黄酮的含量，从而提高异黄酮的生物利用度[14]。研究表明，高盐稀态发酵工艺酿造的酱油中，大豆苷质量浓度为0.035 4 mg/mL，染料木苷质量浓度为0.000 5 mg/mL，大豆苷元质量浓度为0.006 6 mg/mL，染料木素质量浓度为0.000 6 mg/mL，大豆皂苷质量浓度为8.942 4 mg/mL。该工艺酿制的酱油发酵时间较短，但样品中大豆异黄酮和皂苷的质量浓度较高，因此证明该酱油是具有一定功效的健康食品。高盐饮食是诱发高血压的重要因素之一，任洁等人[15]的研究表明，高盐饮食喂养大鼠，会导致大鼠的血压升高和造成肾脏损伤。酱油中虽然含有较高的盐分，但是对血压具有一定的调节作用，Mun E G等人[8]研究表明，韩国传统发酵酱油对高盐饮食诱发的大鼠高血压具有显著的调节作用。动物试验已经证明，中国传统发酵酱油对高脂高盐饮食诱发的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠高血压具有积极的调节作用。试验中，大鼠经12周灌胃含盐量为8%的中国传统发酵酱油，与高脂高盐饮食（含盐8%）摄入组相比，酱油灌胃组血清中的瘦素（高脂+高盐饮食组含量3 145.9±293.5 pg/mL，高脂+酱油饮食组含量2 435±268.1 pg/mL；含盐8%）；脂联素（高脂+高盐饮食组含量3 741.9±250.7 pg/mL，高脂+酱油饮食组含量5 323.3±181.8 pg/mL；含盐8%）水平和肾素（高脂+高盐饮食组含量21.0±0.77 pg/mL，高脂+酱油饮食组含量13.1±2.2 pg/mL；含盐8%）水平都得到显著改善。假设酱油中的大豆异黄酮和皂苷是调节脂质和瘦素水平的主要功效成分，因此对中国传统酱油中的大豆异黄酮和大豆皂苷成分的分析，将为进一步证明中国传统酱油对高血压的调节机制提供重要参考。