加工番茄新番72号再生体系的建立

2021-06-06张西英刘江娜张爱萍

中国瓜菜 2021年3期

张西英刘江娜张爱萍

摘要：为建立一套优化的组织培养和遗传转化再生体系，以加工番茄新品种新番72号为试材，分别选取4～8 d苗龄无菌苗的子叶和下胚轴为外植体，研究了不同苗龄、外植体、激素浓度配比对番茄愈伤组织诱导、不定芽分化的影响，以建立番茄再生体系，为下一步基于CRISPR-Cas9定点突变改良新疆加工番茄耐贮性奠定基础。结果表明，新番72号加工番茄再生体系建立中以苗龄6 d的子叶为最佳外植体，愈伤诱导、芽分化率及生长情况均优于下胚轴;愈伤诱导最佳培养基为MS+0.5 mg·L-1 IAA+2.0 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1 ZT，子叶的诱导率为90.5%，下胚轴的诱导率为80.8%;继代培养芽分化的最佳培养基为MS+0.2 mg·L-1 IAA+1.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 ZT，子叶的芽分化率较高，可以达到85.3%。

关键词：番茄;耐贮;子叶;再生体系

Abstract： To establish a set of optimal tissue culture and genetic transformation regeneration system， Xinfan 72 was used as material in this research， the cotyledon and hypocotyl of 4-8 days of aseptic seedlings were selected as explants， the effects of different seedling ages， explants and hormone concentrations on callus induction and adventitious bud differentiation in tomato were studied， in order to establish tomato regeneration system， lay the foundation for the next preliminary research on improving the storage tolerance of Xinjiang processed tomato based on CRISPR-Cas9 site-directed mutation. The results showed that cotyledons of 6d seedling age were the best explants in the regeneration system of Xinfan 72 tomato， and the callus induction， bud differentiation and growth were better than hypocotyl. The optimal callus induction medium was MS+0.5 mg·L-1 IAA+2.0 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1 ZT， and the induction rate of cotyledons and hypocotyls were 90.5% and 80.8%， respectively. The best medium for bud differentiation in the secondary culture was MS+0.2 mg·L-1 IAA+1.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 ZT.

Key words： Tomato; Storage-resistant; Cotyledons; Regeneration system

番茄（Lycopersium esculentum Mill.）是一种重要的经济作物和模式植物。近年来，研究人员已经利用组织培养技术培育出大量组培番茄[1-7]，并将其广泛应用于番茄基因工程相关研究，自农杆菌介导番茄叶盘转化法以来，番茄作为转基因受体植物的研究得到迅速发展。虽然番茄的再生体系研究较多，但是不同基因型番茄的再生条件有很大的差异[8-15]，并且加工番茄与鲜食番茄之间及不同的加工番茄品种之间存在着不同的再生转化体系[12]。

新番72号属加工番茄早熟品种，田间综合抗性较强，适宜新疆各地种植[16]，目前对其再生体系的研究还未见报道，因此研究其组培再生体系的建立，为利用此品种进行相关基因遗传转化等研究提供理论依据和技术支持，具有一定的应用价值。笔者以新番72号番茄为试材，分别选取无菌苗的子叶和下胚轴为外植体，分析不同苗龄、不同激素配比对新番72号番茄愈伤诱导、不定芽分化的影响，筛选出最佳外植体和激素浓度组合，以期建立一套優化的新番72号番茄组织培养再生体系，为完善加工番茄再生体系研究及相关各领域研究提供一定的参考与理论依据，并为进一步基于CRISPR-Cas9定点突变改良新疆加工番茄耐贮性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

番茄品种为新番72号，由新疆第六师农业科学研究所番茄课题组选育。母本A-10 是从里格尔87-5中筛选出综合抗性好的株系，经过8代自交提纯得到的稳定材料，属早熟加工番茄品种;父本MG-01是从国外引进的加工番茄材料JQ-23，经7代分离、纯化得到的稳定、早熟品系。

1.2 培养基

种子萌发培养基：1/2MS培养基（1/2MS大量元素+MS微量元素+MS铁盐+MS有机物质，不加蔗糖，0.7%琼脂，pH 5.8～6.0）。

预培养基： MS（大量元素+MS 微量元素+MS 铁盐+MS有机物质+ZT 2 mg·L-1+IAA 0.1 mg·L-1;蔗糖 30 g·L-1）+5 g·L-1琼脂粉，pH值5.8。

愈伤诱导培养基：MS（大量元素+MS微量元素+MS铁盐+MS有机物质;蔗糖 30 g·L-1）+5 g·L-1琼脂粉+不同浓度的ZT、IAA、6-BA，pH值5. 8。

芽分化培养基 MS（大量元素+MS 微量元素+MS铁盐+MS有机物质;蔗糖 30 g·L-1）+5 g·L-1琼脂粉+不同浓度的ZT、IAA、6-BA，pH值5.8。

1.3 方法

1.3.1 无菌苗的培养选取籽粒饱满、大小均一的番茄种子0.6 g，在超净工作台内加入50 mL 75%的乙醇，灭菌30 s，期间不断晃动，将乙醇倒出，用无菌水冲洗2遍，然后加入27 mL的无菌水和3 mL的漂白剂，放到摇床上摇1 h 10 min，摇好后将液体倒出，用无菌水冲洗5遍，稍微留一点水，放到4 ℃冰箱过夜;将灭菌后的种子从冰箱里拿出来，播种到1/2 MS培养基中，每瓶接种50～60粒种子，接种完后直接放到组培室或人工气候箱里培养，温度设置为25～28 ℃、光照度1800 lx、光照处理16 h、黑暗处理8 h，4～8 d后获得无菌苗。

1.3.2 苗龄试验试验选取苗龄为4、6和8 d的番茄子叶或下胚轴作外植体，剪取子叶和下胚轴进行培养，接种于MS+IAA 0.1 mg·L-1+ZT 2.0 mg·L-1培养基中，培养20 d左右，在外植体基部的切口或伤口处形成愈伤组织和不定芽，观察外植体的愈伤生长及芽分化情况，确定最适宜的番茄无菌苗苗龄。每个处理接种20个外植体，3次重复。

1.3.3 愈伤诱导及芽分化试验选取苗龄为6 d的番茄子叶或下胚轴作外植体，剪取子叶和下胚轴进行培养，接种于不同激素浓度的愈伤诱导和芽分化培养基中，观察统计外植体的愈伤生长及芽分化情况。每个处理接种40个外植体，3次重复

1.3.4 数据处理愈伤诱导率/%=产生愈伤的外植体数/接种的外植体数×100;芽分化率/%=产生芽的外植体数/接种的外植体数×100。数据采用Excel 2007处理，取3次重复的平均值±SD。

2 结果与分析

2.1 苗龄对番茄愈伤组织及不定芽诱导的影响

对不同苗龄番茄的子叶与下胚轴进行愈伤组织诱导，分析不同苗龄与外植体愈伤诱导率之间的关系。由表1可知，4 d苗龄的子叶还未完全展开，50%以上的外植体褐化，形成的愈伤组织黄化，后期芽分化率较低，原因可能是较低苗龄的子叶自身的修复能力弱，影响了细胞全能性;6 d苗龄子叶和下胚轴的愈伤出现时间早，其中80%以上的子叶出现愈伤，愈伤诱导率和分化率都较高;8 d以上苗龄有其他子叶长出，叶片老化，外植体再生诱导时愈伤组织后期易出现褐化现象。苗龄为6 d的子叶和下胚轴外植体所形成的愈伤组织呈淡绿色或绿色，生长速度快，分化能力较强，所以新番72号番茄再生体系建立中以苗龄6 d的子叶为最佳。

2.2 不同激素浓度配比对愈伤组织和芽分化诱导的影响

由表2～3可知，在不同激素组合的培养基上均能不同程度地诱导出愈伤组织，但诱导率和芽分化率存在一定差异，在同等浓度的激素下子叶和下胚轴的诱导率差异不大，但在继代分化培养中，子叶芽分化率明显高于下胚轴，下胚轴诱导出的愈伤后期分化出芽较少，有的会分化出叶片，但没有中心生长点，不能形成完整带芽植株;在加有6-BA的培养基中子叶和下胚轴的诱导率和分化率稍高一些，但6-BA浓度不能太高，否则会影响愈伤的诱导和分化。其中在最适激素浓度的培养基上诱导出的愈伤组织结构致密，体积大，生长速度快，将愈伤组织转入分化培养基上继续培养，部分愈伤组织可分化出不定芽，其中激素质量浓度为MS+0.5 mg·L-1 IAA+2.0 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1 ZT愈伤组织诱导率最高，其子叶的诱导率为90.5%，下胚轴的诱导率为80.8%;在继代培养中20～30 d后愈伤组织开始分化出现小芽或丛生芽，激素质量浓度为MS+0.2 mg·L-1 IAA+1.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 ZT子叶和下胚轴的愈伤组织产生的芽分化率较高，可以达到85.3%，在此培养基中不定芽生长健壮、数目较多，每个外植体平均再生芽数达到2.8个（图1～3）。

3 讨论与结论

理论上植物的组织和器官都可以作为建立再生系体和基因转化的外植体，但不同植物间、同种植物不同品种间、同一品种植物不同组织器官间，在脱分化能力、再分化能力、细胞全能性潜在趋势及感受态程度等方面都有很大差别，因此不同类型外植体对离体培养的反应是不同的，培养效果不同，分析原因可能主要与基因型有关，不同品种基因型不同，外植体再生能力也不同，因此有必要选择再生培养效果最好的外植体，以利于进行后续工作。

在新番72号番茄再生体系建立中，苗龄6 d的子叶為最佳，这与前人[12-13，18-19]的研究结果不同，可能与番茄不同品种基因型、无菌苗的培养环境不同有关，从而延长或缩短了再生培养中最佳苗龄时间的选择，因此，选择适宜苗龄的无菌苗外植体是提高再生出芽率的关键。诱导新番72号愈伤的最佳培养基是MS+0.5 mg·L-1 IAA+2.0 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1 ZT，继代培养芽分化的最佳培养基为MS+0.2 mg·L-1 IAA+1.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 ZT，同时研究结果表明子叶诱导愈伤组织及芽分化能力优于下胚轴，这与文献[8，11，13]的结果一致，与欧阳波等[7]的研究则相反，造成这种差异的原因：一是幼苗不同部位外植体内源激素浓度不同，对同一培养基表现出不同的敏感性;二是不同部位外植体间酶活性不同。同时已有研究表明基因型是影响番茄组织培养再生体系建立的重要因素[17-20]，因此针对不同品种的加工番茄，探索激素的最佳配比，筛选出分化率高的基因型和外植体材料作为培养对象，对于优化番茄再生体系是非常重要的。

笔者建立了加工番茄新番72号的组培再生体系，为其他品种再生体系的建立提供了一定的理论依据，同时为利用此品种进行番茄遗传转化等基因工程研究奠定了基础。

参考文献

[1] 王美玲，吴巧玲，张喜春.番茄再生体系优化以及ProDH干扰载体的遗传转化[J].中国农学通报，2019，35（21）：125-131.

[2] 于慧敏，石竹，杨俊杰.番茄的不同基因型对组培植株再生能力的影响[J].山东师范大学学报（自然科学版），2007，22（4）：120-130.

[3] 张园，张婉荣，林春，等.富花青素紫色番茄组织培养再生体系的建立[J].北方园艺，2018（18）：47-51.

[4] 唐亚萍，王柏柯，杨生保，等，加工番茄下胚轴再生体系的建立[J].新疆农业科学，2016，53（5）：785-790.

[5] 李文枫，李景富，许向阳，等.耐贮型番茄子叶再生体系建立及优化[J].东北农业大学学报，2014，45（2）：24-28.

[6] 刘士勇，刘守伟.番茄组织培养中应注意的问题[J].北方园艺，2006（2）：119-120.

[7] 欧阳波，李汉霞，叶志彪.玉米素和IAA对番茄子叶再生的影响[J].植物生理学通讯，2003， 39（3）：217-218.

[8] 孙祥科，李媛媛，刘雪，等.不同激素对“五彩珍珠”番茄再生体系的影响[J].北方园艺，2017（8）：85-89.

[9] 王傲雪，趙越，陈秀玲，等.不同激素组合对番茄芽分化率的影响[J].东北农业大学学报，2013，44（7）：85-90.

[10] 王娟，程籍，李立芹，番茄“嘉宝”子叶再生体系的建立[J].北方园艺，2010（20）：130-132.