西藏自治区牦牛出血性败血症的诊治

边巴 德吉

（1.西藏林芝市朗县农业农村局畜牧兽医防疫站，西藏 林芝 860000；2.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏 拉萨 850009）

牛出血性败血症又简称牛出败，是由多杀性巴氏杆菌感染引发牛出现以呼吸道症状和组织器官出血症状为主的急性、热性传染病，急性发病病程较短，常引起患牛死亡，群体中一旦有动物感染，则可威胁到同群其他动物［1］。多杀性巴氏杆菌可感染多种家畜，对于幼畜更易感染，幼畜感染后死亡率高于成年动物。近年来，关于牛出血性败血症的研究报道仍旧较多，结合现有资料表明，牛出败已经对我国牛产业发展造成一定威胁［2］。

本病例中发病牦牛经临床和实验室诊断，确诊为多杀性巴氏杆菌感染，根据本试验药敏结果用药以及对假定健康群体进行疫苗免疫后，疫情风险一周内得以消除。通过本研究的开展，能够为西藏地区牦牛牛出败的防治提供宝贵参考，同时能够引起养殖户对于牛出血性败血症的重视。

1 材料和方法

1.1 样品来源

西藏自治区某牧民家中死亡牦牛肺脏和肝脏。

1.2 仪器设备及试剂

5%绵羊鲜血琼脂培养基、MH（A）培养基购自青岛海博生物有限公司；生化鉴定管、药敏片购自杭州微生物试剂公司；分子生物学试剂购自迪宁生物；电热恒温培养箱购自上海精宏仪器厂；引物合成和测序由上海生工完成。

1.3 细菌培养

于实验室内使用接种环将病料接种于血琼脂平板，置于电热恒温培养箱中36±1℃培养24 h，挑取菌落进行革兰氏染色镜检，而后挑取单菌落再次接种于血琼脂平板同样条件进行培养。

1.4 生化鉴定

挑取纯化培养物接种于生化鉴定管中，于电热恒温培养箱中36±1℃培养24 h～48 h观察记录结果。

1.5 16S rRNA基因PCR扩增及测序

挑取从死亡牛4 份肺脏和4 份肝脏病料中获得的8 株分离菌菌落，添加于无菌蒸馏水中，100 ℃加热10 min 后，12000 rpm 离心2 min 获得DNA。PCR 扩增引物为27F:5′— AGAGTTTGATCCTGGCTCAG — 3′和

1492R：5′— TACGGC TACCTTGTTACGACTT — 3′，目的条带大小为1300 bp。反应体系为20μL，反应程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，共30 个循环；72℃10min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并将PCR扩增产物送至上海生工测序。

1.6 动物致病性试验

将27 只小鼠随机分为9 组（n=3），实验组8 组，对照组1组。实验组分别以8株分离株的108cfu/mL 生理盐水菌液0.2mL 腹腔注射小鼠，对照组使用无菌生理盐水0.2mL腹腔注射小鼠，观察记录小鼠注射后变化。

1.7 药物敏感性试验

将新鲜菌液浓度调整至麦氏值0.5，均匀涂布于MH（A）琼脂，使用纸片法进行药敏试验，参照纸片法药敏判定标准判定结果。

2 试验结果

2.1 细菌分离培养

肺脏和肝脏病料接种培养24h 后，血琼脂平板表面均可见针尖样大小、露珠状、边缘整齐、透明的菌落。革兰氏染色为阴性菌，菌体呈短球杆状（图1），菌落形态结合染色镜检结果，初步怀疑为多杀性巴氏杆菌。

图1 革兰氏染色镜检10mm×100mm

2.2 生化鉴定

生化鉴定试验结果表明，8 株分离株蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露醇和触酶试验为阳性，乳糖、吲哚、M.R和V.P 试验为阴性。生化鉴定结果与《伯杰氏细菌手册》对比发现，分离株与多杀性巴氏杆菌生化反应较为一致。

2.3 16S rRNA基因PCR和测序

PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳，分离株均扩增到约1300 bp 的目的条带（图2）。扩增产物测序结果登录NCBI网站比对，结果表明8株分离株均与多杀性巴氏杆菌序列相似性达90%，确定所分离细菌为多杀性巴氏杆菌。

图2 PCR扩增产物电泳图

2.4 小鼠致病性试验

实验组小鼠均于48 h 内死亡，死亡小鼠可见出血性肺炎、肝脏肿大、肠道充血。于死亡小鼠的肺脏和肝脏均再次分离到多杀性巴氏杆菌，证实所分离的多杀性巴氏杆菌菌株能够引起小鼠病变，由此推测多杀性巴氏杆菌可能为本次引发牦牛感染死亡的病原菌。

2.5 药物敏感性试验

根据纸片扩散法药敏实验标准，测量抑菌环直径后得到以下结果（表1）。

表1 药物敏感性试验结果

3 分析与讨论

多杀性巴氏杆菌对多种动物均可造成威胁［3］，同群中有感染发病动物时，即可成为传染源，家畜中以猪牛羊发病较多。通常认为，牛出血性败血症的主要传染源是病牛［4］，病牛继续通过分泌物和排泄物排出病原体，造成环境、水、饲料和用具受到污染，造成进一步传播，也可通过呼吸道飞沫和吸血昆虫传播［5］。该病没有明显的季节性，但与热、冷、热、湿和雨季交替、拥挤、通风不良、饲料突变、过度疲劳、长途运输、寄生虫感染等因素造成应激或抵抗力下降时，病原体可能利用它引起疾病［6-7］。

本研究中，由现场调查、临床症状观察和实验室诊断，最终确定该农户家中牦牛死亡是由于多杀性巴氏杆菌感染引起。在实验室诊断过程中，及时建议养殖户进行病牛隔离治疗的同时加强消毒和紧急接种，最终疫情得到有效控制。通过本试验的进行，能够为牛出败的防治和科学研究提供一定参考。