一种纤维素降解复合菌剂在羊粪堆肥中的应用效果评价

吴庆珊，周桂雄，方 正，贺鹏亮，翁庆北**

(1.贵州师范大学生命科学学院，贵州 贵阳550025；2.贵州师范大学生物学国家级实验教学示范中心，贵州贵阳550025)

近年来，随着中国强农惠农政策的实施，畜禽养殖业呈现出集约化规模化发展势头，因畜禽养殖而导致的环境污染问题也日益突出[1].据2019年中国统计年鉴显示，2018年底全国羊存栏数29713.5万只，年产羊粪约28198.11万t，大量的畜禽粪便亟需采取有效措施进行处理，否则将引起严重环境污染问题[2-3].同时，粮食的工业化生产使土壤肥力在不断降低[4].堆肥化处理畜禽粪便是目前最有效的处理方式之一，堆肥后的有机肥施用于土壤不仅可以增加土壤养分和有机质含量，还可改善土壤理化性质和提高土壤质量[5-6]，在减少畜禽粪便负面环境影响的同时，更有效地将畜禽粪便转化为有价值的肥料.

堆肥化处理是指依靠微生物分解将生物废物（如畜禽粪便，污泥和垃圾等）中的有机物转化为稳定腐殖质的生物化学处理技术[7].畜禽粪便中含有丰富的养分，是具有巨大潜力的资源库[8].与其它动物粪便相比，羊粪中有机质和氮、磷、钾含量较高，养分更丰富，是良好的有机肥资源[9].然而，由于羊是典型的食草型动物，其粪便中含有大量较难分解的纤维素类物质，严重制约着堆肥化处理效果，致使堆肥发酵时间较长，有机质转化效率低等[10].

微生物群落在堆肥过程中起着重要作用[11].大量研究表明，接种外源微生物是加速高温好氧堆肥进程的有效途径[3,5,12-13].增加特定种类的微生物可加速堆肥初期基质的分解，加快木质纤维素的降解，促进堆体后熟，缩短堆肥周期[6,14].尽管目前国内市场上存在多种微生物堆肥促腐菌剂，但用于羊粪堆肥发酵时往往存在发酵周期长、腐熟度低、纤维素类物质降解不彻底等问题.因此需要针对发酵物料的种类筛选适宜菌种，以便保证发酵效果.本试验将前期复配的纤维素降解复合菌剂接种于羊粪堆肥发酵，与商品菌剂进行堆肥比较，以发酵过程温度变化及发酵产物的安全性为考核指标，评价该纤维素降解复合菌剂的发酵效果，以期获得可应用于羊粪堆肥发酵的高效堆肥腐熟辅助菌剂，为进一步利用羊粪资源化生产有机肥提供理论基础和实践指导.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌剂 纤维素降解复合菌剂M（菌剂M）所含菌株均由作者前期从贵州省羊粪自然发酵堆、牛粪自然发酵堆、腐烂稻草堆中分离筛选所得，经本实验室利用形态学和16SrRNA基因序列分析，初步鉴定为湖南类芽孢杆菌（Paenibacillus hunanensis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilissubsp.subtilis）、暗红灰链霉菌（Streptomyces erythrogriseus）、嗜热喜粪链霉菌（Streptomyces thermocoprophilus）、青霉菌（Penicilliumsp.）和Penicilliumcecidicola（其分离、筛选和相关生物学特性已另文撰写）.促腐菌剂R（菌剂R）购于河南省鹤壁市人元生物技术发展有限公司，根据前期调研，该菌剂用于羊粪堆肥发酵腐熟效果较好，但存在纤维素降解不彻底问题，故选择该菌剂作对比菌剂.混合菌剂MR（菌剂MR）为菌剂M（有效活菌数2.35×108cfu·g-1）和菌剂R（有效活菌数≥1.00×1010cfu·g-1）按1∶1质量比（m∶m）复配所得，经拮抗性检验表明菌剂M所含菌株与菌剂R之间无拮抗作用[15].

1.1.2 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯（PDA）培养基和高氏一号培养基的配制参照文献[16].

1.1.3 堆肥原料 新鲜羊粪来源于贵州省贵阳市修文县白山羊养殖基地（东经106°29′39″，北纬26°55′14″，海拔523 m）；水稻秸秆来源于贵州省贵阳市花溪区党武镇摆牛村（东经106°36′5″，北纬26°22′11″，海拔1 181 m）.以新鲜羊粪作主要原料，水稻秸秆（长约1～5 cm）为调节填充剂进行堆肥发酵，堆肥物料初始理化性质见表1.

表1 堆肥原料初始理化性质Tab.1 Initial physical and chemical properties of compost raw materials

1.2 试验方法

1.2.1 堆体建立及菌剂添加 将新鲜羊粪和秸秆按碳氮比约25∶1进行混合均匀，调整含水率（50%～60%）后进行分堆（约250 kg/堆），按每堆质量的0.2‰添加固体菌剂，其中，菌剂M有效活菌数为2.35×108cfu·g-1，菌剂R有效活菌数≥1.00×1010cfu·g-1.经充分搅拌后制成龟背形发酵堆，每堆即为1个处理组.为进一步验证菌剂M的强化作用，分别以菌剂R和菌剂MR作为发酵菌剂进行对比试验.堆肥试验以不添加菌剂作为空白对照处理组（CK处理组），以添加菌剂M为试验处理组，以添加菌剂R和菌剂MR为对比试验处理组进行堆肥试验，每个处理组重复3次.

1.2.2 堆肥管理及样品采集 堆体建立当天记为第0天，每天记录1次堆体温度，当堆体温度下降时采用人工翻堆方式进行翻堆处理，实际翻堆时间分别在第8天、第15天和第25天.在翻堆时，根据堆体物料含水率进行补水管理.堆肥样品的采集以堆体中心为原点，在约10 cm半径内从堆体右、中、左3处各采集样品约100 g置无菌密封塑料袋中.取样前，测量堆体温度、记录堆体的气味，取样后观察样品颜色、颗粒度等物理变化.

1.2.3 堆肥各项指标测定 气味、颜色、颗粒度等感官判断和温度、含水率、pH值和种子发芽指数（germination index,GI）测定参照文献[17]；纤维素和半纤维素含量测定参照文献[18-19]；滤纸酶（FPase）、羧甲基纤维素酶（CMCase）和β-葡萄糖苷酶（β-Gase）酶活测定参照文献[20]；有机碳、全氮（total nitrogen,TN）、速效磷（以P2O5计）和速效钾（以K2O计）测定由杨凌启翔生物科技有限公司采用重铬酸钾容量法、凯氏定氮法和火焰光度法完成；有效活菌数、粪大肠菌群数和蛔虫卵死亡率的测定参照文献[21-23]；碳氮比（C/N）为总有机碳与全氮的质量比.

1.2.4 数据分析 采用SPSS 20.0软件进行数据处理和统计分析，用Origin 8.5软件作图.各处理平均数间的多重比较采用邓肯氏新复极差测验（Duncan’s new multiple range test），在p=0.05条件下，分析差异显著性.

2 结果与分析

2.1 堆肥过程中物料感官变化根据感官判断堆肥过程中物料气味、颜色和颗粒度的变化.堆肥第0天，堆体为黄棕色，有较强臭味，团块和秸秆多.随着堆肥发酵天数增加，堆体温度升高，堆体表面出现大量水蒸气.在堆肥高温阶段第8天翻堆时，堆体内可见大量灰白色菌丝，如图1.其中，添加菌剂（M、R和MR）处理组堆体中的灰白色菌丝较CK处理组多，表明菌剂（M、R和MR）的添加增加了堆肥物料中的微生物类群和数量，大量微生物的繁殖有助于堆体物料中有机物质的降解.堆肥结束（第25天）后，添加菌剂（M、R和MR）处理组的颜色为深褐色，土腥味，团块和秸秆微量，符合生物有机肥农业行业标准（NY884—2012）感官要求，而CK处理组颜色为暗褐色，微土腥味，团块和秸秆较多（图2）.这些现象表明菌剂M所含微生物类群适应该环境生长，适用于羊粪堆肥发酵研究.

图1 堆肥过程中高温阶段前期（第8天）物料状况Fig.1 Material condition in theearly stage of high temperaturestage(Eighth day)during composting

图2 堆肥过程中腐熟阶段（第25天）物料状况Fig.2 Material condition in maturity stage (25th day)during composting

2.2 堆肥过程中温度的动态变化堆肥过程中，温度变化可以反映微生物的生长繁殖和分解代谢过程[5].由图3可知，添加菌剂（M、R和MR）处理组的堆体升温较CK处理组迅速，堆肥发酵最高温度优于CK处理组，表明在堆肥发酵中通过添加外源微生物增加堆体物料中微生物的类群和数量，可以加速微生物对堆体物料的氧化分解发酵，增加产热，促使温度快速上升[24-26].按照无害化标准要求，堆体温度超过50℃下保持10 d可杀灭粪便中的病原体及其他有害物质[27].本试验中菌剂M添加处理组在第4天达到无害化标准要求（＞50℃），并在高温阶段（＞50℃）维持了11 d，与菌剂R和菌剂MR处理组达到无害化标准要求的时间和高温保持时间相同，均较CK处理组达无害化标准要求缩短了1 d，高温维持时间增加了2 d，表明添加菌剂M到羊粪堆肥发酵中可以促进堆肥发酵.另外，第15天翻堆时因室内温差较大，堆体温度散失较快，加之补水管理和可直接利用的营养物质减少，从而影响了堆体升温，但添加菌剂M、R和MR发酵后的堆体温度较CK处理组的高5.7～14.3℃.可见，本研究的菌剂M用于羊粪堆肥发酵可加速堆肥发酵进程.

图3 堆肥过程中温度的变化Fig.3 The temperature changesin the compost process

2.3 堆肥过程中含水率和p H的变化根据生物有机肥国家农业行业标准（NY884—2012）要求，堆肥发酵后生物有机肥的含水率应小于30%，pH值范围为5.5 ～8.5 .

堆肥过程中，水分是反应微生物活跃程度的重要因素之一，微生物代谢会消耗大量水分，以及堆体升温也会蒸发大部分水分，从而使含水量降低[28].由图4A可知，各处理组的含水率随堆肥发酵天数的增加逐渐降低.堆肥结束（第25天）时，添加菌剂M、R和MR处理组的物料含水率由堆肥初期（第0天）的63.32%、63.31%和64.43%分别降低为44.1 5%、43.0 7%和40.2 5%，较CK处理组（50.7 1%）的低6.5 6%～10.4 6%.其中，菌剂M和R处理组的含水率相当，菌剂MR处理组的含水率较低.由于堆肥翻堆过程中进行了补水管理，以至于4个处理组堆肥结束后含水率均大于30%.因此，本研究后续堆肥发酵时需要控制好补水管理时间.

图4 堆肥过程中含水率（A）和p H（B）的变化Fig.4 Changesof water content (A)and pH (B)during composting

由图4B可知，各处理组的pH随堆肥发酵天数增加逐渐降低.堆肥结束（第25天）时，添加菌剂M、R和MR堆肥发酵后，pH分别降至8.40、8.42和8.28，均低于CK处理组（8.76），呈现偏碱性，符合NY884—2012标准要求.其中，菌剂M和菌剂R相当，菌剂MR最低.可见，添加微生物菌剂处理组分解有机物产生的有机酸类物质积累较CK处理组多，更有利于堆肥过程中减少氨的挥发[13].

2.4 堆肥过程中发芽指数（GI）的变化GI是检测堆肥发酵无害化和腐熟程度的重要指标，当GI值超过80%时，表明堆肥已完全腐熟[29].由图5可知，堆肥发酵第21天时，添加菌剂M处理组的GI值（100.8 6%）显著高于CK处理组的（71.7 7%）（p＜0.0 5），达到完全腐熟状态，且与菌剂R（104.2 4%）和菌剂MR（100.4 1%）无显著差异（p＞0.0 5）.CK处理组在堆肥发酵第25天时才完全腐熟，且GI值（82.56%）低于菌剂M处理组（98.20%），表明添加的菌剂M可以促进堆肥腐熟，缩短堆肥时间.

图5 堆肥过程中GI的变化Fig.5 Changesof GI during composting process

2.5 堆肥过程中碳氮比、全氮、速效磷和速效钾的变化碳氮比常用于堆肥腐熟指标判断，前人研究认为碳氮比小于20，T值（终点碳氮比/初始碳氮比）小于0.6 时堆肥达到腐熟[7].从表2可知，各处理组的碳氮比随堆肥发酵天数增加逐渐降低，堆肥结束（25 d）时，添加菌剂M、R和MR发酵后的碳氮比由初始（0 d）的23.3 9分别下降至12.7 7、12.3 6和10.81，显著低于CK处理组（16.44）的（p＜0.05）.其中，菌剂M处理组与菌剂R处理组无显著差异（p＞0.05），但显著高于菌剂MR处理组的（p＜0.05）.且添加菌剂（M、R和MR）处理组的T值均小于0.6 ，CK处理组为0.7 .表明本研究添加的菌剂M可以加速堆体中有机物的降解，有利于促进堆肥腐熟.

表2 堆肥前后物料理化性质的变化Tab.2 Changesof physical and chemical propertiesof materials before and after composting

各处理组的全氮、P2O5和K2O含量随堆肥发酵天数增加逐渐增加.堆肥结束（25 d）时，添加菌剂M、R和MR处理组的全氮质量比较初始（0 d）分别增加了32.55%、33.69%和41.80%，P2O5质量比较初始（0 d）分别增加了45.40%、48.51%和69.9 8%，K2O质量比较初始（0 d）分别增加了51.7 8%、51.5 4%和68.0 2%，均显著高于CK处理组的（p＜0.0 5）.其中，菌剂M处理组的全氮质量比与菌剂R和MR处理组无显著差异（p＞0.0 5）；但其P2O5和K2O质量比均显著低于菌剂MR处理组的（p＜0.0 5），与菌剂R处理组的无显著差异（p＞0.0 5）.表明菌剂M添加到羊粪堆肥发酵中可提高堆肥肥效.另外，堆肥结束时P2O5和K2O增量较全氮增量大，这是由于在堆肥过程中磷素和钾素不会挥发损失，而氮素较易转化为氨随温度升高挥发所致[30].

2.6 堆肥过程中纤维素和半纤维素含量的变化随着堆肥发酵天数增加，各处理组的纤维素和半纤维素含量逐渐降低，降解率逐渐增加.在堆肥发酵第15天、第25天时，添加菌剂M、R和MR发酵后，纤维素和半纤维素的降解率较CK处理组显著增加（p＜0.0 5）.在堆肥发酵第25天时，4个处理组的纤维素和半纤维素质量分数分别由初始（第0天）的41.3 7%和43.2 1%分别降低至29.5 6%～31.6 0%和25.7 7%～32.1 9%.其中，菌剂M处理组（纤维素质量分数30.1 0%，降解率28.3 3%）的纤维素降解率显著高于菌剂R处理组（纤维素质量分数31.60%，降解率为24.76%）的（p＜0.05），与菌剂MR处理组（纤维素质量分数29.56%，降解率29.62%）无显著差异（p＞0.05）（图6A）；但菌剂M处理组（半纤维素质量分数27.98%，降解率38.32%）的半纤维素降解率显著低于菌剂MR处理组（半纤维素质量分数25.7 7%，降解率43.2 1%）的（p＜0.0 5），与菌剂R处理组（半纤维素质量分数28.7 1%，降解率36.7 1%）无显著差异（p＞0.0 5）（图6B）.说明添加菌剂M有助于促进堆体物料中纤维素和半纤维素降解.

图6 堆肥过程中纤维素降解率（A）和半纤维素降解率（B）的变化Fig.6 Changesof cellulosedegradation rate(A) and hemicellulosedegradation rate (B)during composting

2.7 堆肥过程中纤维素酶活性的变化FPase、CMCase和β-Gase的酶活变化可反映微生物对纤维素类物质的降解效果[19].由图7可知，在堆肥发酵高温阶段（4～8 d），4个处理组物料中的FPase、CMCase和β-Gase酶活均达到最高，随后酶活逐渐下降.除CK处理组的FPase酶活、菌剂MR处理组的CMCase酶活、菌剂R处理组和CK处理组的β-Gase酶活在第8天时出现微增长外，菌剂M、R和MR处理组的FPase酶活（57.8 0、68.0 9 U·mL-1和76.9 9 U·mL-1）、CMCase酶活（10.4 1、11.0 8 U·mL-1和11.7 7 U·mL-1）和β-Gase酶活（75.7 7、82.9 1 U·mL-1和106.9 4 U·mL-1）在第4天时达最高.其中，菌剂M处理组的FPase、CMCase和β-Gase酶活均显著高于CK处理组（38.5 3、8.8 8 U·mL-1和47.3 4 U·mL-1）的（p＜0.0 5）；较菌剂R处理组相比，其FPase酶活显著高于菌剂R处理组（p＜0.0 5），其CMCase和β-Gase酶活与菌剂R处理组无显著差异（p＞0.0 5）；但其3种酶活均显著低于菌剂MR处理组的（p＜0.0 5）.表明添加菌剂M可促进堆体物料中纤维素和半纤维素的降解.

2.8 堆肥发酵后其它指标测定堆肥发酵结束（第25天）后，对4个处理组中的有效活菌数、大肠杆菌和蛔虫卵检测表明，除CK处理组的蛔虫卵死亡率（94.09%）未达标外，各处理组中的有效活菌数（≥0.2×108cuf/g）、大肠杆菌数量（≤100 cuf /g）和蛔虫卵死亡率（＞95%）均符合国家农业部行业标准（NY88—2012）要求.此外，添加菌剂M、R和MR处理组的总养分含量均大于5.00%，符合NY88—2012要求，可应用于农业生产.其中，菌剂M处理组的总养分质量分数为8.76%，较CK处理组（7.60%）提高了15.26%.

3 讨论

畜禽粪便堆肥化处理是目前常用的无害化处理方法，通过添加外源微生物菌剂来加快有机物降解，提升有机肥质量是目前最有效的途径之一[11].本研究将前期复配的纤维素降解复合菌剂M接种于羊粪堆肥发酵.结果表明，添加菌剂M发酵后，较CK处理组相比，堆体升温达无害化标准要求（＞50℃）缩短了1 d，高温时间延长了2 d，堆肥腐熟时间缩短了4 d，总养分提高了15.26%.可见菌剂M用于羊粪堆肥发酵能明显加速堆肥腐熟时间，提高有机肥养分.

图7 堆肥中纤维素酶活性的变化Fig.7 Changes of filter paper cellulase activity(A),CMC cellulase activity(B)and betaglycosidase activity(C)during composting process

在堆肥过程中，缩短堆肥发酵周期是堆肥研究的关键[30-31].本研究添加菌剂M发酵后，堆体在第21天时检测达无害化标准要求，较张喜庆[32]、孙海英[33]等将纤维素降解菌添加到牛粪堆肥发酵的堆肥发酵周期（25～30 d）稍短.推测其原因为张喜庆、孙海英等仅添加单一纤维素降解菌株进行堆肥发酵，而本试验所使用的菌剂M含细菌、真菌和放线菌多种纤维素降解菌株，存在多菌株间的协同作用及互利共生效应更有利于堆肥发酵[34].与劳德坤等[35]在蔬菜副产品中微生物腐熟菌剂堆肥发酵周期（14 d）相比，本研究的堆肥周期稍长.分析其原因可能是蔬菜副产品的纤维素含量低，对堆肥的限制影响较小.

本试验堆肥过程中，纤维素和半纤维素降解是本研究关注的重点.降解率与李红亚等[36]的研究结果相似，但与刘月[37]、石其伟[38]，Zhou等[39]的研究结果相比，本研究菌剂M的纤维素和半纤维素降解均较低. 究其原因除堆肥原料及微生物菌剂不同外，还可能与堆肥周期长短相关，例如刘月等堆肥发酵46 d，石其伟等堆肥发酵30 d和Zhou等堆肥周期长达50 d，而本研究仅堆肥25 d.刘月等[37]研究也认为木质纤维素类物质在二次发酵后期（31～46 d）会存在较大程度降解；郁红艳等[40]在研究农业废物堆肥的过程中也得到木质纤维类物质素降解在高温阶段后会有很大提升的结论.此外，郁红艳等[40]研究还认为由于纤维素受到木质素的包裹，要在堆肥过程中获得良好的腐熟度，就要加快木质素纤维转化为腐殖质.由此可推测，本研究中纤维素的降解受到木质素降解的影响，以至于纤维素降解率较低.因此，本研究在后期堆肥试验中，如何进一步提高羊粪堆体中纤维素和半纤维素的降解，以及木质素的降解仍是探讨的重点问题.

4 结论

综上所述，本研究前期获得的菌剂M可用于羊粪堆肥发酵，发酵后可增加有机肥的养分含量，缩短堆肥腐熟时间，提高堆体中纤维素和半纤维素的降解.菌剂M与菌剂R混合后的堆肥发酵效果明显，可把菌剂M作为菌剂R的辅助菌剂应用于羊粪有机肥生产中.