山新杨蔗糖合酶基因PCR介导的重组现象研究

葛宝柱，徐 强，陈赢男

(南京林业大学，南方现代林业协同创新中心，林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室， 江苏 南京 210037)

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)能在体外大量扩增微量的DNA，已成为使用最广泛的分子生物学实验技术，在生物学科各个领域和分支都有广泛的应用。利用PCR扩增目标基因开展测序，可以为基因特征和群体遗传动态研究，以及深入了解物种系统发育史提供有价值的分子信息。然而这些应用都是建立在PCR能够准确复制模板序列的基础之上，但PCR介导的重组(PCR-mediated recombination)现象有可能导致嵌合产物的形成，从而影响序列信息的准确性。

PCR介导的重组是指在PCR反应过程中同源序列的扩增片段发生重组，从而在离体条件下产生嵌合产物(chimeric products)或重组分子(recombinant molecules)的现象[1]。在环境微生物群落多样性分析中，由于嵌合产物的形成，会导致生物多样性的估计偏高[2]。在分子进化研究中，嵌合产物的存在也会影响对基因进化的解释[3]。PCR介导的重组也被认为是单分子测序技术产生误差的重要因素之一[4]。因此，在研究中需要警惕PCR介导的重组现象，注意区分扩增产物中的重组分子与真正的原始单倍型序列。但另一方面，对于体外分子进化研究来说，PCR介导的重组可以开发成为能持续提供新基因的潜在工具，这些新基因可以有效地在分子定向进化中加以应用[5]。

前人研究表明，在利用PCR扩增多基因家族或杂合度较高的单基因时，由于反应体系中存在相似度较高的模板序列，比较容易出现PCR介导的重组，产生嵌合产物[6]。山新杨(Populusdavidiana×P.bolleana)是以山杨(P.davidiana)为母本，新疆杨(P.bolleana)为父本，经人工杂交选育的优良无性系，具有抗寒、抗旱和抗病虫等特性，在我国北方广泛种植[7]。由于种间杂交的遗传特性，山新杨基因组高度杂合，为研究PCR介导的重组现象提供了良好材料。蔗糖合酶(sucrose synthase)基因(SuSy/SUS)是广泛存在于植物中的基因家族，同源基因数目为5～7个[8]。本研究克隆了7个山新杨蔗糖合酶基因(PdbSUS)的基因组 DNA 和cDNA全长序列，发现多个基因的扩增产物中存在PCR介导的重组现象。在确定山新杨为二倍体植株的基础上，通过对蔗糖合酶基因家族各成员的单倍型分析，发现嵌合产物的存在，利用测序结果中不同序列类型所占比的不同，鉴定原始单倍型和重组分子，为后续研究提供准确的序列信息。多数木本植物基因组杂合度较高，单纯地参考基因组序列能够提供的信息有限，单倍型可以区分不同亲本染色体的遗传信息，对深入了解单条染色体或特定染色体区域的序列和结构特征非常重要。因此，本研究也为木本植物中多基因家族克隆过程中判定真实的单倍型遗传信息提供参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料

以生根培养1个月的山新杨组培苗为实验材料，采集新鲜幼嫩叶片，将样品立即置于液氮中速冻并在-80 ℃冰箱储存备用。组培苗培养条件：平均温度23 ℃，相对湿度70%～75%，光周期为光照16 h/黑暗8 h。

1.2 流式细胞仪检测

利用基因组大小已知的番茄(Lycopersiconesculentum)为对照，分别采集番茄植株和山新杨组培苗新鲜嫩叶各50 mg，置于一次性培养皿中，加入1 mL预冷的LB01缓冲液[9]，在冰上用刀片快速将叶片切碎，用孔径40 μm尼龙网过滤至1.5 mL离心管中。吸取472.5 μL细胞核悬液、25 μL碘化丙啶(1 mg/mL，上海Sigma)和2.5 μL RNase A(10 mg/mL，大连Takara)，混匀后于4 ℃避光染色10 min。染色后立即通过流式细胞仪(Becton Dickinson Biosciences)上机检测，由随机自带软件BD FACSTM Software 1.0.0.650自动生成DNA含量分布曲线图，重复测定3次。

1.3 山新杨基因组DNA及总RNA的提取

分别采用 DNAsecure Plant Kit试剂盒(北京Tiangen)和RNAprep Pure Plant Plus Kit试剂盒(北京Tiangen)提取山新杨基因组DNA和叶片总RNA。DNA和RNA的浓度和质量分别用NanoDrop 2000(南京ThermoFisher)和琼脂糖凝胶电泳检测。以提取的总RNA为模板，采用FastKing One Step RT-PCR Kit试剂盒(北京Tiangen)进行反转录，得到cDNA。

1.4 山新杨蔗糖合酶基因全长序列的克隆及分析

毛果杨(P.trichocarpa)基因组V3.1(https://phytozome.jgi.doe.gov)中共注释有7个蔗糖合酶基因(基因号：POPTR_0018s07380、POPTR_0006s13900、POPTR_0002s20340、POPTR_0015s05540、POPTR_0012s03420、POPTR_0004s07940、POPTR_0017s02060)，以这些基因的基因组 DNA及cDNA全长序列为参考，利用Primer Premier 5.0软件设计引物，由上海生工生物工程有限公司合成。分别以提取的基因组DNA和反转录得到的cDNA为模板，采用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase试剂盒(大连Takara)扩增山新杨蔗糖合酶基因的基因组DNA及cDNA全长序列。PCR反应体系为50 μL：5× PrimeSTAR GXL Buffer 10 μL，dNTP Mixture 4 μL，正向和反向引物各2 μL，模板2 μL (5 ng/μL)，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase酶1 μL，双蒸水29 μL。反应程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸，35个循环，72 ℃彻底延伸7 min。引物序列及PCR反应延伸时间见表1。

表1 扩增山新杨PdbSUS基因全长序列的引物序列及延伸时间

表1(续)

将PCR扩增产物进行凝胶分离纯化，连接pEasy-Blunt Zero载体(北京全式金)，利用热激法转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆进行菌液PCR验证，将整合有外源片段的转化子送南京生工生物工程公司进行测序。利用SnapGene©(http://www.snapgene.com/)对测序结果进行分析，去除目的片段以外的载体上的序列，再利用DNAMAN对测序结果进行比对分析。

1.5 质粒DNA提取及酶切反应

利用Easy Pure Plasmid MiniPrep试剂盒(北京全式金)提取质粒。利用SnapGene©分析PdbSUS2和PdbSUS5基因两种单倍型的酶切位点，酶切位点数量设置为1～2，其他参数均保持系统默认；根据以下原则进一步筛选软件查找到的酶切位点：①同一个基因的2种单倍型之间存在酶切多态性；②在pEasy-Blunt Zero载体骨架序列上不存在酶切位点。最终选用EcoT22 I和NheI分别单酶切PdbSUS2的两种单倍型和重组型质粒；采用NdeI、ClaI和MfeI分别单酶切PdbSUS5的两种单倍型和重组型质粒。

2 结果与分析

2.1 流式细胞仪检测山新杨倍性水平

利用细胞流式仪测定结果见图1。以番茄(基因组大小约为900 Mb[10])为内参，山新杨基因组大小约为480.6 Mb(图1)。根据已报道的二倍体毛果杨的基因组大小(约485 Mb[11])，判断出山新杨为二倍体植株。

左侧峰为山新杨；右侧峰为内参(番茄)。The left and right peak represents P. davidiana×P. bolleana and internal references (Lycopesicon esculentum).图1 流式细胞仪测定山新杨基因组大小Fig.1 Estimations of genome size of P. davidiana× P. bolleana by using flow cytometry

2.2 PCR介导的重组

以山新杨基因组DNA为模板扩增得到7个蔗糖合酶基因的基因组 DNA全长片段，扩增产物清晰、单一且无非特异扩增(图2)。将这些目标片段克隆测序，结果显示，所有基因扩增产物的长度均与预期基本吻合(表2)。

M．BioGold 5 000 Plus DNA maker.图2 山新杨蔗糖合酶基因的基因组 DNA(A)和 cDNA(B)全长序列的扩增Fig.2 A full-length amplification of genomic DNA (A) and cDNA (B) sequences of PdbSUS genes of P. davidiana× P. bolleana

山新杨为种间杂交二倍体植株，理论上其每个基因的扩增产物应包括2种不同的单倍型(纯合位点除外)。分别比对7个山新杨蔗糖合酶基因的基因组 DNA片段测序结果，发现PdbSUS4的测序结果仅检测到1种单倍型(16个克隆)，这可能由于该基因的两种单倍型之间不存在单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)差异(纯合位点)；也有可能由于SNP差异恰好位于引物区域，导致1个单倍型未被扩增或者单倍型差异被掩盖。PdbSUS3和PdbSUS6各检测到两种单倍型。意外的是，在PdbSUS1、2、5、7的测序结果中检测到的序列类型(单倍型)均大于2，其中PdbSUS1的序列类型(单倍型)最多，为5个(表2)，为探明其中原因，进一步对这些基因的测序结果进行了详细比对。

表2 山新杨蔗糖合酶基因测序结果统计

序列分析发现，PdbSUS1、2、5、7基因的测序结果中均存在嵌合产物。为便于表述，本研究将每个基因测序结果中占比最多的前两种序列类型定义为该基因的单倍型I(Haplotype Ⅰ)和单倍型Ⅱ(Haplotype Ⅱ)，将嵌合产物(即重组分子)定义为R型，详细结果在图3中展示。如图3A所示，在PdbSUS1基因测序的20个克隆中，分别有14个和3个克隆可以归类为Haplotype Ⅰ和Haplotype Ⅱ，另外还有3种R型序列各有1个克隆。根据Haplotype Ⅰ和Haplotype Ⅱ之间的SNP差异，序列比对显示PdbSUS1-R1的1～1 293 bp和2 087～3 955 bp与Haplotype Ⅰ序列完全一致，推测这2个区段在PCR反应过程中的模板为PdbSUS1基因的Haplotype Ⅰ序列；而1 294～2 086 bp与Haplotype Ⅱ序列完全一致，推测该区段扩增模板为PdbSUS1基因的Haplotype Ⅱ序列。同样，可以判断PdbSUS1-R2的1～552 bp和1 551～3 935 bp的扩增模板为PdbSUS1基因的Haplotype Ⅱ序列，而553～1 550 bp的扩增模板为该基因的Haplotype Ⅰ序列；PdbSUS1-R3的1～2 035 bp的扩增模板为PdbSUS1基因的Haplotype Ⅱ序列，而2 036～3 955 bp的扩增模板为该基因的Haplotype Ⅰ序列。PdbSUS1测序结果中3种重组分子的存在说明在该基因的扩增过程中，发生了Haplotype Ⅰ和Haplotype Ⅱ之间的模板转换(template-switching)，或者说是PCR介导了PdbSUS1的两种原始单倍型在体外发生了重组，由此导致其测序结果中检测到两种以上的序列类型。此外，在PdbSUS2、5、7的测序结果都有两种嵌合产物(图3A)。在7个PdbSUS基因基因组 DNA全长片段的104个测序克隆中，12个克隆含有嵌合产物，占比11.5%。

在以山新杨cDNA为模板扩增得到的7个蔗糖合酶基因cDNA全长(图3B)的测序结果中，同样发现了PCR介导重组的现象。PdbSUS1-c和PdbSUS6-c的测序结果中仅检测到两种不同单倍型序列；但PdbSUS2-c、3-c、5-c、7-c的测序结果中均检测到3～4种不同的序列类型(表2)。例如在PdbSUS2-c的10个测序克隆中，分别有5个和3个克隆可以归类为Haplotype Ⅰ和Haplotype Ⅱ，还有两个克隆为R型序列(图3B)。在7个PdbSUS基因cDNA序列测序的105个克隆中，6个克隆含有R型序列，占比5.7%。

在所有含有嵌合产物的克隆(18个)中，有11个克隆含有的序列发生1次模板转换事件；3个克隆发生2次模板转换(PdbSUS1-R1,PdbSUS1-R2和PdbSUS7-R2)；两个克隆发生2次模板转换(两个PdbSUS5-R1克隆)，两个克隆发生4次模板转换(两个PdbSUS2-R2克隆)，各基因发生模板转换的位置具有随机性(图3)。此外，本研究中发现的嵌合产物均来自同一个位点不同等位基因之间的重组，没有发现不同蔗糖合酶基因之间发生重组的现象。Judo等[5]发现简单重复序列或较高的GC含量会提高PCR介导重组的概率。提取本研究测序结果中所有R型序列，截取这些序列中发生模板转换位置上下游各100 bp，对这些区间的碱基组成及序列特征进行分析，GC含量为34.83%～50.75%，未发现上述序列特征。

A.山新杨7个蔗糖合酶基因基因组DNA序列的单倍型及重组型Haplotypes and recombinant types of genomic DNA sequences of 7 SUS genes of P.davidiana×P.bolleana； B.山新杨7个蔗糖合酶基因cDNA序列的单倍型及重组型。Haplotypes and recombinant types of cDNA sequences of 7 SUS genes of P.davidiana×P.bolleana.括号中的数字表示检测到的非重组或重组产物的克隆数。The numbers in the bracket represent the clone numbers found for the non-recombinant and recombinant products.图3 PCR介导的重组现象Fig.3 PCR-mediated recombination

2.3 酶切反应验证PCR介导的重组

利用限制性酶切多态性对PdbSUS2和PdbSUS5基因的R型质粒进行了验证，结果见图4。如图4所示，EcoT22 Ⅰ和NheⅠ分别酶切PdbSUS2的两种单倍型均可以产生两种不同带型，EcoT22 Ⅰ酶切PdbSUS2-R1产生的谱带与PdbSUS2的Haplotype Ⅱ一致，NheI酶切该质粒产生的带型与Haplotype Ⅰ一致。同样，由图4可以看出PdbSUS2-R2、PdbSUS5-R1和PdbSUS5-R2的酶切谱带在不同单倍型之间的转换。由此，进一步证明了本研究所检测到的重组分子不是由于测序错误产生，而是PCR反应介导产生的两种原始单倍型的重组产物。

P. 未经酶切的质粒 undigested plasmid；M. BioGold 5 000 Plus DNA marker；Ⅰ. 单倍型Ⅰ Haplotype Ⅰ；Ⅱ. 单倍型Ⅱ Haplotype Ⅱ；R1. 重组型1 Recombinant 1；R2.重组型2 Recombinant 2。图4 限制性酶切分析Fig.4 Restriction digestion analyses

3 讨 论

PCR介导的重组在20世纪80年代就已被发现[12]，但在国内却鲜有报道。二倍体山新杨基因组的两套亚基因组分别来自山杨和新疆杨，同一位点不同单倍型之间存在丰富的SNP差异，有利于及时发现PCR介导的重组现象，准确区分重组分子与原始单倍型才能为后续研究提供准确的序列信息。本研究扩增的山新杨14个基因组 DNA和cDNA片段中，有18个片段的测序结果中检测到嵌合产物，不同基因产生嵌合产物的概率为0～33.3%。这一比例与前人在其他物种中的研究报道相吻合。Cronn等[6]克隆了异源四倍体陆地棉(Gossypiumhirsutum)的4个低拷贝基因(Myb3、Myb5、G1262和CesA1)，发现其中3个基因(Myb3、Myb5和CesA1)的扩增产物中存在PCR介导的重组分子，这些重组分子在陆地棉的两套亚基因组(A和D)之间随机变换，3个基因产生重组分子的概率分别为5.6%、31.1%和88.9%。此外，Yu等[13]基于3种不同的RNA编码基因(四膜虫核酶、大肠杆菌核糖体小亚基rRNA和海豹主要组织相容性复合体)，利用限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)技术检测到PCR嵌合产物形成的比例超过20%。即使是扩增HIV1病毒tat基因的242 bp片段也检测到嵌合产物发生概率大约是5%[14]。可见，PCR介导的嵌合产物的产生不是罕见现象，而是一种PCR反应过程中衍生重组分子的高频事件。

一般来说，目的片段越长产生PCR介导重组发生的概率越高[15]，本研究也发现扩增山新杨蔗糖合酶基因组DNA全长产生重组分子的比例高于cDNA全长。此外，在PCR扩增过程中有多种因素可能影响嵌合产物或重组分子的形成，包括模板的起始浓度、延伸时间和循环次数等。较高的模板浓度和循环次数会提高产生重组分子的概率[16-18]，而采用较长的延伸时间可以降低PCR重组的概率[5, 19]。DNA聚合酶是PCR反应最为关键的组分，不同类型的DNA聚合酶产生重组分子的概率也不同。Shafikhani[20]比较了Taq、Pfu和RTth/Vent3种DNA聚合酶产生重组分子的概率，发现Pfu聚合酶可以显著减少嵌合产物的形成。基于半圆表壳虫(Arcellahemisphaerica)8个actin基因部分序列的研究，Lahr等[16]发现相比Vent聚合酶, 具有相同保真性能但延伸能力更强的Phusion聚合酶产生重组分子的概率更低。

对于PCR介导重组分子形成的机制，目前主要有两种解释，即“引物延伸不完全(incomplete primer extension)”和“模板转换”[19]。前者认为当PCR反应体系中存在序列高度相似的模板时，前一轮未完全延伸的产物可能在下一轮反应过程中与高度相似但并非完全匹配的模板退火，从而导致嵌合产物的形成[5, 21-22]。Judo等[5]利用两个具有4碱基差异的DNA分子(590 bp)为混合模板，通过控制PCR反应温度证明引物的不完全延伸确实可以导致嵌合产物的形成。“模板转换”机制提出：模板链可能和反应体系中其他相似性较高的DNA单链发生部分复性，形成具有高级结构的杂合分子，导致引物延伸至不同DNA链的交汇点时不再按照初始模板链而以其他DNA链为模板继续延伸[19]。Odelberg等[1]为“模板转换”机制提出了两种可能的模型：转换发生在新合成的DNA链之间(a switch between nascent strands)和转换发生在已有的DNA链之间(a switch to preexisting template)。在综合分析本研究得到的所有PdbSUS基因嵌合产物的基础上，笔者认为，虽然 “引物延伸不完全”机制能够解释发生1次重组的嵌合产物，但仍不能很好地解释多次重组的嵌合产物是如何形成的，如本研究中的PdbSUS1-R1、PdbSUS1-R2存在不同单倍型序列之间的2次重组，PdbSUS5-R1存在不同单倍型序列之间的3次重组现象；而“模板转换”机制能够更好地解释复杂嵌合产物的形成。在PCR反应过程中，这两种作用机制都有可能导致嵌合产物的产生。Potapov等[4]提出模板中存在的颈环二级结构也有可能引起“模板转换”的发生，导致产生多种类型的嵌合产物，这也为更为深入理解PCR介导重组的现象提供了有益的参考。