梅州金柚食用后期的苦味来源分析

钟永辉，刘智慧，钟玉鸣，马路凯，柳建良，刘袆帆，王琴，吴晖，赖富饶，肖更生

（1.广东省梅州市梅县区农业科学研究所，广东梅州 514783）（2.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州510000）（3.华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）

柚子（Grapefruit），金柚属柑橘类（Citrus）植物，口感酸甜，深受广大消费者喜爱[1]，是岭南特色水果[2]，其中梅州有 “ 中国金柚之乡 ” 之称，是我国金柚最大的生产地[3]。但金柚食用后期口感变苦的问题日益严重，已影响到金柚产业的可持续发展，因此探究金柚苦味的形成原因对解决该问题至关重要。有关文献报道，导致柑桔果实变苦主要有两类物质：一是柠檬苦素类似物（Limonoids），包括柠檬苦素（Limonin）和诺米林（Nomilin）[4]。另一类为黄酮类化合物，包括柚皮苷、新橙皮苷，其中柚皮苷是主要的苦味物质（Naringin）[5]。

目前，对柚子苦味的研究多数集中在高度氧化的三萜类化合物和黄酮类化合物，但柚子的理化性质如可溶性固形物、可滴定酸、质构与苦味形成之间的关系少见描述。可溶性固形物、可滴定酸度及质构特性是衡量果蔬品质的重要指标[6-8]。已有学者报道测定水果的质地参数进而预测其品质是可行的。

因此，本研究拟通过感官评分将金柚分为I、II、III级；测定金柚的苦味物质并对其组成进行分析，同时对金柚果肉的物理性质如硬度、粘附性等进行测定，并与感官品质进行关联，通过建模分析影响梅州金柚苦味形成的主要因素，为金柚脱苦、快速检测等方面的研究提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金柚来自梅州市梅县区，在金柚的 “ 始采日 ” 后采摘柚果[3]，从同一果园随机抽取色泽、大小均一的金柚，室温储存运输。将金柚平均分为3组，以组为单位进行测定。每组取3瓣完整的柚果肉进行质构的测定，其余用组织捣碎机榨汁，过滤后储存在4 ℃备用检测理化指标。

乙腈、磷酸、氢氧化钠、酚酞、草酸铵、二甲基酰胺、乙酸、甲醇均为分析纯，购自天津市大茂化学试剂厂；柠檬苦素（Limonin）、诺米林（Nomilin）、柚皮苷（Naringin）均为标准品，购自上海源叶生物科技有限公司；实验用水均为超纯水。

1.2 仪器与设备

TA500质构测定仪，Lloyd-instruments Co.Ltd.英国；LC-20AT高效液相色谱仪，岛津企业管理（中国）有限公司；FZ102微型植物粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；LH-B55手持折光计，杭州陆恒生物有限公司。

1.3 感官品质评定方法

1.3.1 感官属性的确定

通过评定员集体对沙田柚初步品尝和讨论，挑选甜度、酸度和苦味3个感官属性描述沙田柚果实。

1.3.2 感官评定的实施

感官评定由5组、每组3人的评定员分5批次完成，评定员从梅县金柚公司中挑选，相当于初级评定员。对每个金柚进行编号后，采用3个等级描述感觉强度（表1），对每个样品的果肉进行均分、编号。在组织者讲解评定要求和方法后，由每位感官评定员独立评定、不进行交流和讨论。在评定每个样品前都用矿泉水漱口，每个样品评定间隔1～3 min。

表1 感官评价与分级标准Table 1 Sensory evaluation and grading standards

1.4 梅州金柚理化指标测定方法

1.4.1 可溶性固形物含量

参考GB/T 12143-2008折光计法，所有样品均进行3次平行试验。

1.4.2 可滴定酸度

根据GB 12293-90滴定法进行测定，具体操作如下：吸取1 mL果汁，定容至10 mL容量瓶，作为待测样液。用移液管吸取10 mL样液，加入酚酞指示剂5～10滴，用0.01 mol/L氢氧化钠标准溶液滴定，至出现微红色30 s内不退色为终点，记下所消耗的体积。并按如下公式计算：

式中：c：氢氧化钠标准溶液摩尔浓度，mol/L；V1：滴定时所消耗氢氧化钠标准溶液体积，mL；V0：吸取滴定用的样液体积，mL；m或V：试样质量g或体积mL；10：定容体积，mL；k：柑橘类换算为结晶柠檬酸克数的系数，0.070。

1.4.3 果肉质构

采用余恺等人[9]方法进行检测：将试验样品平放于样品放置台，采用柱形探头沿底座滑槽向下移动将样品挤压。起始力2 N，测试速度60 mm/min，形变百分量为20%。取最大粘附力、粘附性、起始模量、硬度进行下一步分析。

1.4.4 柠檬苦素和诺米林含量

采用HPLC法测定金柚的柠檬苦素和诺米林的含量[10,11]。

样品处理：准确吸取柚果果汁5 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，摇匀，超声处理20 min，用0.45 μm微孔滤膜过滤，平行制备3份待测液。

高效液相色谱条件：AgilentZORBAXSB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈:0.1%磷酸水=55:45（V/V）；柱温35 ℃；流速1 mL/min；进样量10 μL；检测波长为210 nm，波长扫描范围为200～400 nm。

柠檬苦素和诺米林的标准曲线绘制：分别准确称取柠檬苦素和诺米林标准品90 mg，用乙腈超声辅助溶解并定容至1000 mL，摇匀，配成质量浓度均为90 mg/L的标准溶液。再依次稀释成0.9、1.8、4.5、9.0、18、45 mg/L的柠檬苦素和诺米林标准溶液，以质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标分别绘制柠檬苦素和诺米林标准曲线。

1.4.5 柚皮苷含量

参考文献方法[12]提取柚皮苷，具体如下：料液比1:28（V/V）加入乙醇，置于超声波提取容器中，设定超声功率600 W提取71 min。并用NT/T 2014-2011的HPLC法进行测定。

1.4.6 数据处理

以上所有实验设3个平行，实验结果用平均值±标准差（mean±SD）的方式表示。采用SPSS Statistics 25软件进行单因素方差分析；pheatmap软件进行热图与聚类分析；randomforest软件分析随机森林与重要性；PAST 4.1软件计算spearman相关性；Origin Pro绘制相关度和相关系数图；Excel绘制标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 指标测定结果

表2 指标测定结果Table 2 Indicator measurement results

通过上述方法，测定每组样品的可溶性固形物、可滴定酸、硬度、最大粘附力、粘附性、起始模量、柠檬苦素、诺米林、柚皮苷含量，并根据感官评分将样品分为I、II、III三级，数据如表2所示。

I级、II级、III级的感官评分为1.85、4.73、7.5分，在本次取样中，感官评分较低，金柚苦味严重，且I、II、III级苦味差异显著，代表性强。

Eshed[13]认为可溶性固形物能影响果蔬风味，可溶性固形物含量越高，口感越佳；施堂红[14]等人证明随着存放时间的增加，柚果实中的淀粉大量转化为可溶性糖，进而使果实甜美。可滴定酸含量在2.3%～3.5%范围内，但I级、III级差异较小，这可能与梅州金柚本身酸度不高的这一因素有关[15]。

金柚的硬度在15 N～17 N范围内，李丽娜[8]认为果肉硬度越大、黏性越小，果肉越柔韧细腻、口感越好；赵亚等人[16]发现最大粘附力越大，果实软化程度越低。柚子的粘附性低于0.1 g.sec。起始模量在2.2 N/mm～3.4 N/mm，这可能是由于柚子果肉不规则，对质构造成一定影响。

柠檬苦素、诺米林、柚皮苷标准品的峰面积与浓度的线性回归方程分别为y=4453.8x+29541、y=5296.1x+13874、y=32799x-2510.7，线性关系R2分别为0.9996、0.9999、0.9998。果汁中柠檬苦素的苦味阈值约为3.4 mg/L，金柚的柠檬苦素含量在11.06 mg/L～21.94 mg/L范围，均大于苦味阈值；而诺米林在果汁中的苦味阈值约为4.39 mg/L[17]，金柚中诺米林含量在6.76 mg/L～42.9 mg/L范围内，远高于其阈值，影响了金柚口感。Ohta等[18]对16种成熟柚果实的分析表明，柚汁柠檬苦素类似物平均含量为18 mg/L。本文发现柚皮苷含量在6.45 mg/L～19.68 mg/L，白小鸣[19]研究指出柚皮苷在水中的苦味阈值为20 mg/L，在果汁中约为30 mg/L，金柚中柚皮苷含量低于其阈值，表明柚皮苷不是苦味形成的因素。

2.2 感官评分与各项指标的总体联系

不同指标可以在一定程度上反映其相关品质，王颖等人[20]将26份马铃薯按矿质元素的含量将其分为6类，研究其含量与基因的相关性，筛选出了优异基因型。金柚的感官评分与各项指标的热图与聚类分析如图1a所示，在纵向聚类的结果中展示出化学物质如柚皮苷、诺米林、柠檬苦素与可溶性固形物、硬度聚类在一组，表明可溶性固形物与硬度有密切联系。

感官评分与各项指标的相关系数如图1b所示，梅州金柚果肉的感官评分与可溶性固形物含量（R=0.79）有极显著正相关关系，与苦味物质诺米林呈极显著负相关（R=-0.0.69），与苦味物质柚皮苷呈显著负相关（R=-0.59）。柚皮苷对金柚口感的影响也很明显，Gil-Izquierdo A等人[21]研究发现柚皮苷类物质是风味物质和抗氧化物质，其含量影响果汁的色泽、口味、稳定性。金柚的感官与可滴定酸度、硬度、最大粘附力、起始模量、粘附性、柠檬苦素没有显著相关，表明可溶性固形物含量和诺米林含量对梅州金柚的感官影响较大。

图1 感官评分与各项指标的关系Fig.1 Relationship between sensory score and various indicators

图2 不同感官等级下各项指标的变化Fig.2 Changes of various indexes under different sensory levels

2.3 感官与各项指标的联系

不同感官等级金柚品质如图2所示，由图可知感官评级随着可溶性固形物含量的升高而增大，呈正相关，这可能是因为柚子中丰富的维生素C、果糖、葡萄糖、蛋白质等，均易溶于水，使金柚口感更甜，感官评分也随之上升。

在I、II级时，感官评级随着可滴定酸的降低而上升，在II、III级时，感官评级随着可滴定酸的上升而降低，但II、III级可滴定酸度均低于I级，可滴定酸与感官总体上呈负相关；诺米林和柠檬苦素含量与感官评分呈负相关，III级的金柚中诺米林与柠檬苦素含量较低，金柚感官品质随着诺米林和柠檬苦素含量的增加而降低。有研究报道，柠檬苦素与诺米林在果实中以无苦味环内酯的状态存在，但酸性条件下，其可以迅速转化为有苦味的柠檬苦素和诺米林[22]。柚皮柑含量与感官评价呈负相关，感官等级随着柚皮苷含量的减少而升高。Bar-Peled M等人[23]发现了柚皮苷致苦的关键物质，柚皮苷在查尔酮酶催化成柚皮苷配基查尔酮，在1,2-在鼠李糖基转移酶的作用下，进一步糖基化生成有苦味的柚皮苷。

硬度对感官评级总体呈正相关，这可能是由于金柚的质地较为特殊；粘附性、最大粘附力、起始模量、可滴定酸对感官的影响不显著。

2.4 各项指标间的相关性分析

图3 各项指标间的相关系数Fig.3 Correlation coefficient between various indicators

由图3可知，可溶性固形物与诺米林（R=-0.72）、柚皮苷（R=-0.76）呈极显著负相关；诺米林与柚皮苷呈极显著正相关（R=0.78），与柠檬苦素（R=0.42）呈显著正相关；柚皮苷与柠檬苦素呈极显著正相关（R=0.68）；表明柚皮苷对诺米林、柠檬苦素、可溶性固形物含量具有关键作用，可溶性固形物与感官评分呈显著正相关，而柚皮苷、柠檬苦素、诺米林均具有苦味，对感官造成不良口感，是主要的苦味物质。柠檬苦素类似物主要以游离苷元和配糖体的形式存在，苷元在酸性条件下会很快的转变成苦味物质，而柠檬苦素、诺米林就是含量较高的柠檬苦素类化合物游离苷元[24]。王壮[25]发现柚子中含有较高含量的柚皮苷，严重影响其品质。

最大粘附力与粘附性呈极显著负相关（R=-0.74），与起始模量呈显著负相关（R=-0.40）。陈青[26]等人认为当果实的最大粘附力越低，果实细胞间空隙越大，果实的起始模量与粘附性程度越高。

2.5 感官与各项指标的相关度分析

以感官评分为变量，各项指标为自变量，用random forest模型预测各项指标与感官评分的关联度。

图4 感官品质与各项指标的相关度Fig.4 The degree of correlation between sensory quality and various indicators

感官品质与各项指标的相关度如图4所示，由图可知各指标与感官品质的相关度排序如下：可溶性固形物＞诺米林＞柠檬苦素＞柚皮苷＞最大粘附力＞起始模量＞可滴定酸＞粘附性＞硬度。其中与感官品质相关度最高的为可溶性固形物、诺米林、柠檬苦素和柚皮苷，硬度，最大粘附力、起始模量、可滴定酸、粘附性与感官品质相关度最低。金柚感官品质与诺米林、可溶性固形物、柚皮苷含量相关，Jin X等人[27]将豆浆的口感、气味、外观和口感4个感官品质属性量化，并通过模糊逻辑技术构建权重标准进行评分。最终建立了豆浆整体感官评分的预测模型，可为豆浆加工中大豆品种选择提供参考。刘袆帆等人[28]利用随机森林法，建立了通过硬度预测香蕉成熟度的模型。

3 结论

本研究分别建立感官与可能引起苦味的物理、化学因素的相关性，探究梅州金柚食用后期苦味形成的主要原因，结果发现梅州金柚的感官品质与可溶性固形物含量（R=0.79）密切相关，同时与诺米林（R=-0.0.69）、柚皮苷（R=-0.59）关联度较大。在后续的研究中可将可溶性固形物、诺米林含量、柚皮苷含量作为梅州金柚感官品质的评价指标，通过建立金柚整体感官评分的预测模型，进而实现快速评测金柚的品质。