低共熔溶剂杏仁种皮提取物对油茶籽油氧化稳定性的影响

熊 颖 钟海雁 周 波

(林产可食资源安全与加工利用湖南省重点实验室1，长沙 410004)(中南林业科技大学食品科学与工程学院2，长沙 410004)(湖南省森林植物园3，长沙 410116)

杏仁种皮又被称为杏仁种衣、杏仁红衣，颜色深黄，约占果实干质量的2%～5%[1]，是杏仁深加工过程中的副产物，除了少数被用作饲料之外，大部分都被丢弃[2]。杏仁种皮含有大量多酚，目前已检测到杏仁种皮含有儿茶素、山柰酚、槲皮素、柚皮素、绿原酸、表儿茶素等[3-7]，是一种理想的天然抗氧化剂的来源。溶剂提取法是目前工业上最常见的天然活性物质分离方式，但是溶剂提取法常伴随大量有机溶剂的消耗，溶剂回收较复杂，并且有机溶剂的大量应用容易造成环境的污染。低共熔溶剂(Deep Eutectic Solvents，DESs)是一种新型绿色溶剂，这类溶剂由于可降解、可回收、提取效率高而备受科研工作者的青睐，国内外许多学者开始利用低共熔点溶剂提取植物活性成分，如黄酮[8]、多酚[9]、皂苷[10]等。

油茶是我国四大木本油料之一，油茶籽油富含不饱和脂肪酸，其中油酸质量分数高达75%～80%，是一种理想的食用油来源，油茶籽油在运输和储藏过程中易发生氧化，可通过添加一定量的抗氧化剂来减缓其氧化，有研究表明杏仁种皮的存在对提高油脂氧化稳定性有重要意义[14]。从杏仁种皮中提取出来的酚类物质是纯天然抗氧化剂，如果能应用于油茶籽油中不但能延长油的货架期降低油茶籽油的添加成本的同时，起到资源循环高值化利用的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

油茶籽油、杏仁种皮(山杏)、没食子酸(纯度>98%)、原儿茶酸(纯度>98%)、3,4-二羟基苯乙酸(纯度>98%)、儿茶素(纯度>98%)、绿原酸(纯度>98%)、没食子酸丙酯(纯度>99%)；甲醇和冰乙酸为色谱纯；其他试剂为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

CP224C型电子天平，WF-04B型粉碎机，1200型高效液相色谱仪，ZORBAX SB-C18分析型色谱柱，892型Rancimat油脂氧化稳定性测定仪，TITREX 2000微调型电子滴定仪，DHG-9070A型高温鼓风干燥箱，UV-1100型紫外可见分光光度计，RTC型集热式磁力搅拌器，HJ-4A型数显控温磁力搅拌器。

1.2 方法

1.2.1 溶剂的制备

低共熔点溶剂的组成见表1，所述组分和比例进行混合并在水浴加热条件下搅拌直至形成稳定的无色透明液体，制备的液体均以100%、90%、75%和50%的质量浓度配制不同的浓度梯度。配制4种传统溶剂：60%甲醇、60%乙醇、酸化甲醇(甲醇/水/12 mol/L HCl，70∶29∶1)、去离子水。

表1 低共熔点溶剂的组成

1.2.2 提取物的制备

杏仁种皮处理：将杏仁种皮放入粉碎机中磨粉，随后取出放入研钵内用适量液氮进一步研磨，过80目筛，杏仁种皮粉用密封袋装好封口，于4 ℃保存。

酚类的提取参照文献方法并加以改进[15]：准确称取0.50 g杏仁种皮粉，以1∶10的料液比将杏仁种皮粉和溶剂置于烧杯中，以保鲜膜封口，在25 ℃下搅拌提取12 h，随后将混合物于4 000 r/min下离心20 min，取上清液并用对应的DESs将上清液定容至5 mL即为提取物。

1.2.3 总酚含量的测定

总酚的测定采用福林酚法，参照GB/T 8313—2008并略作调整，取1 mL提取物稀释10倍后得待测液。取1 mL待测液于10 mL容量瓶加入0.2 mL 福林酚试剂，摇匀后静置3～8 min，然后加入2 mL15% Na2CO3溶液，加蒸馏水定容至刻度后摇匀，避光反应30 min，测定760 nm处的吸光度，记为A1，去离子水调零。操作均重复3次，杏仁种皮总酚含量由公式计算，总酚含量以没食子酸当量计(mg/g)。

总酚含量=C×V×d/m

式中：C为待测液总酚质量浓度；V为提取物定容体积；d为稀释因子；m为样品质量。

标准曲线的制作：配制浓度为0.1 mg/mL的没食子酸标准溶液，分别移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL没食子酸标准溶液于10 mL容量瓶中，加入2 mL福林酚试剂，摇匀后避光静置3～8 min，然后加入2 mL的15%Na2CO3溶液，加蒸馏水定容至刻度后摇匀，避光反应30 min，测定760 nm处的吸光度，去离子水调零，绘制标曲(Y=0.084 5X+0.058 5，R2=0.997 9)。

1.2.4 提取物的HPLC分析

根据本实验室条件设置参数为：流动相A为甲醇；流动相B为0.2%乙酸水溶液；色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速1.0 mL/min；柱温箱25 ℃；检测波长280 nm；洗脱程序设置如下：0～5 min流动相A由10%增加至20%，5～18 min流动相A增加至35%，18～22 min流动相A增加至50%，22～36 min流动相A增加至65%，36～40 min流动相A增加至100%，40～45 min流动相A降至0%。

1.2.5 油茶籽油氧化稳定性测定

Rancimat氧化稳定性测定按照文献方法并加以修改[16，17]：分别称取0.5%、1%、2%、3%、4%的提取物于油茶籽油中，并在油茶籽油中分别加入2%的单甘酯和去离子水，用磁力搅拌器搅拌均匀，溶剂也按同样方法进行处理以排除溶剂干扰，准确称取3.00 g的油样于试管中，按文献设置条件[17]，连接装置，温度稳定后开始通入空气。油茶籽油的氧化稳定性由所测得的氧化诱导时间来表示，其中添加提取物的油茶籽油氧化诱导时间为te，添加溶剂的油茶籽油氧化诱导时间为ts，氧化诱导时间延长量t=te-ts。

Schaal烘箱法：分别称取2%的提取物加入油茶籽油中，用磁力搅拌器搅拌均匀后静置过滤，用高温干燥箱在63 ℃下加热，不间断连续加热20 d，每4 d收集样品并测定油茶籽油加热后的酸价、过氧化值以及p-茴香胺值，油茶籽油酸价按照GB 5009.229—2016所述的方法进行测定，过氧化值按照GB 5009.227—2016的方法进行测定，p-茴香胺值按照GB/T 24304—2009的方法进行测定。

2 结果与讨论

2.1 提取物总酚含量比较

组成DESs的成分不同会影响目标物的提取量。本研究对比了4种传统溶剂和5组低共熔点溶剂在不同浓度下对杏仁种皮多酚的提取效果。不同溶剂对杏仁种皮多酚提取量的影响如图1所示，从图1a可以看出传统溶剂组别中酸化甲醇具有最强的酚类提取能力，去离子水的提取效果最差，从图1b可以看出不同低共熔点溶剂对杏仁种皮的酚类物质提取量有很大的差别，且大部分DESs的总酚提取量均高于传统溶剂。除此之外，DESs的浓度对总酚提取量影响很大，DESs1、DESs2、DESs3、DESs4和DESs5在不同浓度下总酚最高含量分别为最低含量的5.43、3.75、3.37、1.33、2.19倍，且不同种类DESs的多酚提取量随浓度变化呈现出不同的变化趋势。

注：图中不同字母代表数据具有显著性差异(P<0.05)。图1 不同溶剂对杏仁种皮多酚提取量的影响

2.2 提取物的HPLC分析

不同溶剂提取物的HPLC图谱如图2所示，可以看出溶剂种类主要影响提取物的组成，其中传统溶剂、DESs1和DESs4杏仁种皮提取物酚类组成较复杂，且各酚类物质提取量较低，DESs2、DESs3和DESs5杏仁种皮提取物中酚类组成比较单一，且酚类提取量较高，这可能是由于DESs2、DESs3和DESs5组分中含有机酸，酸性条件更加有利于酚类的提取，不同DESs由于溶剂酸度不同，对酚类物质的目标性和提取量会有所区别[19]。从图2b～图2f还可以看出相同的DESs在不同浓度下提取物的酚类物质组成无太大差别，而提取量受浓度影响较大，因此可以推测DESs在不同浓度导致溶剂与酚类物质的作用力大小有所改变，酚类物质的提取量也会随之发生变化[20]。总体来看，DESs在提取量和对酚类物质的专一性方面来看均普遍优于传统溶剂，且DESs对传统溶剂无法高效提取的酚类物质具有较强的针对性，这进一步说明了DESs在活性物质提取方面的优越性。

图2 不同溶剂提取物的HPLC图谱

2.3 提取物对油茶籽油氧化稳定性的影响

2.3.1 提取物对油茶籽油氧化诱导时间的影响

不同溶剂的杏仁种皮提取物对油茶籽油氧化诱导时间的影响如图3a所示，可以看出提取物对油茶籽油的氧化诱导时间均有不同程度的延长。DESs杏仁种皮提取物对油茶籽油氧化诱导时间的延长效果受溶剂浓度影响较大，这主要是由于提取物的总酚含量有所区别导致的，DESs杏仁种皮提取物与传统溶剂相比具有更好的延长油茶籽油氧化诱导时间的效果，DESs2、DESs3和DESs5杏仁种皮提取物总酚含量虽明显高于其他组别，但对油茶籽油氧化诱导时间的影响与其他组别相比区别不大，这可能是因为其他组别提取物总酚含量虽低，但酚类物质组成较复杂，酚类物质之间以及酚类物质与其他物质之间存在协同增效的作用导致的[21，22]。从图3a可以看出当提取物添加浓度为2%时具有较理想的油茶籽油氧化诱导时间延长效果，添加DESs1、DESs2、DESs3、DESs4和DESs5杏仁种皮提取物的油茶籽油在此添加量下氧化诱导时间的延长量分别为1.16、1.13、1.22、1.37、1.16 h，当各组提取物添加量超过2%时油茶籽油氧化诱导时间增加量随添加量变化不大，由此可知2%为较理想的添加量。

图3 不同提取物对油茶籽油氧化稳定性的影响

2.3.2 提取物对油茶籽油酸价的影响

提取物在不同加热时间下对油茶籽油酸价变化量的影响如图3b所示，随着加热时间的增加，空白组油茶籽油酸价的增加量高达0.55 mg/g，添加了杏仁种皮提取物的油茶籽油酸价升高量明显低于空白组，传统溶剂杏仁种皮提取物中酸化甲醇杏仁种皮提取物对油茶籽油酸价升高的抑制效果最好，升高量仅为0.34 mg/g，各组DESs杏仁种皮提取物对油茶籽油酸价升高的抑制效果最好的分别为50%DESs1、100%DESs2、75%DESs3、50%DESs4和100%DESs5，酸价升高量分别为0.24、0.23、0.24、0.26、0.25 mg/g，明显低于添加传统溶剂杏仁种皮提取物的油茶籽油。因此可以看出DESs杏仁种皮提取物具有比传统溶剂杏仁种皮提取物更好的抑制油茶籽油酸价升高的效果，这可能是由于DESs杏仁种皮提取物总酚含量较高导致的。

2.3.3 提取物对油茶籽油过氧化值的影响

提取物在不同加热时间下对油茶籽油过氧化值变化量的影响如图3c所示。可以看出各组油茶籽油的过氧化值均随着加热时间的增加而呈现出增长的趋势，加热20 d后空白对照组的油茶籽油过氧化值增加量为0.86 g/100 g，添加提取物的油茶籽油过氧化值增加量均小于空白组，添加传统溶剂、DESs1、DESs2、DESs3、DESs4和DESs5杏仁种皮提取物的油茶籽油对过氧化值的最高抑制量分别为0.32、0.26、0.72、0.56、0.13、0.47 g/100 g，其中DESs2和DESs3杏仁种皮提取物对油茶籽油过氧化值升高的抑制效果最佳，这可能是由于DESs2和DESs3组别的杏仁种皮提取物中的某些活性成分对抑制油茶籽油过氧化值的升高具有良好的效果。

2.3.4 提取物对油茶籽油p-茴香胺值的影响

提取物在不同加热时间下对油茶籽油p-茴香胺值变化量的影响如图3d所示，随着加热时间的增加，各组油茶籽油的p-茴香胺值均呈现增长的趋势。空白组油茶籽油加热时间为4～16 d时，p-茴香胺值增加量相对较低，但当加热时间为20 d时，空白组油茶籽油的p-茴香胺值增加量可达16.32。添加杏仁种皮提取物的油茶籽油与空白组相比茴香胺值的升高均有明显的减少，这说明提取物能在一定程度上抑制油茶籽油初级氧化产物的进一步分解。添加传统溶剂杏仁种皮提取物的油茶籽油在加热20 d后，p-茴香胺值增加量为空白对照组的87.07%～95.83%，添加各组DESs杏仁种皮提取物的油茶籽油，其p-茴香胺值增加量分别为对照组的69.36%～89.03%、53.68%～81.62%、54.66%～77.02%、58.95%～67.77%和36.83%～62.01%，由此可见DESs组的增量远低于传统溶剂组，其中DESs5杏仁种皮提取物最能体现出对油茶籽油p-茴香胺值升高的抑制效果，这可能是由于DESs5杏仁种皮提取物中的有效成分对油茶籽油p-茴香胺值的升高具有更好的抑制效果。

3 结论

本研究对比了传统溶剂和DESs对杏仁种皮酚类物质的提取效果及其提取物对油茶籽油氧化稳定性的影响。结果表明，DESs对杏仁种皮中的酚类物质具有更好的提取效果，且与传统溶剂相比DESs对某些酚类物质的提取更具有针对性。DESs杏仁种皮提取物与传统溶剂相比具有更好的延长油茶籽油氧化诱导时间的效果。所有提取物对油茶籽油酸价、过氧化值和p-茴香胺值的升高均有一定的抑制效果，而DESs杏仁种皮提取物与传统溶剂相比具有更好的抑制油茶籽油酸价升高的效果，DESs2和DESs3杏仁种皮提取物对油茶籽油过氧化值的升高有良好的抑制效果，DESs5杏仁种皮提取物对油茶籽油p-茴香胺值的升高具有最强的抑制效果。