还原态吡咯喹啉醌清除氮自由基能力研究

马 科 吴贞贞 杨雪鹏

(郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南 郑州 450008)

吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone，PQQ)，是一种含有3个羧基的水溶性醌类化合物，是继核黄素和烟酰胺后的第三类辅酶[1]，广泛存在于母乳、植物、动物组织、某些单细胞真核生物和许多细菌中[2]。作为许多重要酶的辅基，PQQ对生物体具有多种生物功能，如调控基因表达和蛋白质功能[3]、神经保护作用[4]、调节机体自由基水平[5]和信号转导、修复DNA功能[6]等。

在自然界中，吡咯喹啉醌存在醌型(PQQ，氧化态)、半醌型(PQQH)和氢醌型(PQQH2，还原态) 3种可以互相转化的稳定状态(见图1)[7-8]。氧化态PQQ呈醌形式，PQQH2呈邻二酚形式。PQQ可以通过从底物转移两个质子和两个电子转化为PQQH2[9]。作为氧化还原酶的辅基，PQQ 3种状态的转化在底物的氧化还原反应中起到电子传递作用。

图1 PQQ氧化态与还原态转化及电子传递功能Figure 1 PQQ oxidation state and reduction state transformation and electron transfer function

已有研究[10]表明，PQQH2具有良好的抗氧化性，可以有效清除机体活性氧自由基。但是，PQQ对于活性氮(如：ABTS)自由基的清除作用，未见文献报道。活性氮自由基是机体内氧化应激过程的产物，在机体过多地积累会导致慢性炎症，进而引发很多疾病，例如癌症、糖尿病、动脉粥样硬化等[11-12]。试验拟以ABTS自由基的清除能力为指标对PQQH2的抗氧化性进行研究，以期为其作为抗氧化剂在食品中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

PQQH2标品：色谱纯，阿拉丁试剂公司；

维生素C标品：色谱纯，郑州派尼化学试剂公司；

ABTS：分析纯，麦克林生物科技有限公司；

其余试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器设备

分析天平：AB256-S型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

精密pH计：PHS-3D型，上海雷磁仪器厂；

紫外—分光光度计：2300型，尤尼克(上海)有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 清除ABTS自由基的反应动力曲线测定 分别配制PQQH2标准溶液10，30，50，70 mg/L。将PQQH2溶液与0.1 mmol/L的ABTS工作液进行自由基反应，间隔一定时间，测定吸光度，研究PQQH2清除ABTS自由基的速度与时间变化的关系，试验重复3次，以时间为横坐标，清除率为纵坐标绘制反应动力曲线图，按式(1)计算ABTS自由基清除率。

(1)

式中：

a——ABTS自由基清除率，%；

A0——空白对照组的吸光度；

A1——1 mL PQQH2和 ABTS工作液的吸光度。

根据文献[13]，建立反应动力学模型：

(1) 准一级反应动力学方程：

(2)

式中：

Ct——ABTS自由基在t时刻的质量浓度，mg/mL；

C0——ABTS自由基在t=0时的质量浓度，mg/mL；

k1——一级反应速率常数，mg/(mL·min)。

ABTS自由基剩余率：

(3)

式中：

w——ABTS自由基的剩余率，%。

结合式(2)和式(3)得准一级反应动力学方程式：

ln(1-a)=-k1t，

(4)

(2) 准二级反应动力学方程：

(5)

结合式(3)和式(5)得准二级反应动力学方程式：

(6)

式中：

a——ABTS自由基清除率，%；

k2——二级反应速率常数，mg/(mL·min)。

1.2.2 清除ABTS自由基能力半数清除率(IC50)的测定

以维生素C为阳性对照，计算ABTS自由基清除率达到50%时样品的质量浓度。分别配制PQQH2标准溶液10，30，50，70，90 mg/L。将1 mL PQQH2溶液与3 mL 0.1 mmol/L 的ABTS自由基反应，试验重复3次。半数清除率浓度的计算，运用Oringin 9.1进行。

1.2.3 热稳定性研究

(1) 加热温度对PQQH2稳定性的影响：配制30，50，70 mg/L PQQH2标准溶液，分别在相同时间(4 h)、不同温度(30，50，75，100 ℃)水浴下反应，测定PQQH2对ABTS自由基的清除率。

(2) 加热时间对PQQH2稳定性的影响：配制30，50，70 mg/L PQQH2标准溶液，分别在相同温度(100 ℃)、不同时间(4，8，12，24 h)下进行水浴反应，测定PQQH2对ABTS自由基的清除率。

试验重复3次，测定方法参照1.2.1，以维生素C为阳性对照，对PQQH2各项指标作出评价。

2 结果分析

2.1 清除ABTS自由基的反应动力曲线

如图2所示，反应前10 min内，ABTS自由基清除率随反应时间的延长显著提高，PQQH2质量浓度越高，清除效率越高，10 min后ABTS自由基清除速率降低，清除率无显著变化，反应逐渐趋于平衡。并且相同反应条件下，提高PQQH2的质量浓度，ABTS自由基清除率也显著提高，70 mg/L PQQH2相较于10 mg/L PQQH2对ABTS自由基的清除率提升了约3倍，达到了95%左右。试验结果表明，ABTS自由基清除率与PQQH2的质量浓度呈正比。

图2 不同浓度PQQH2清除ABTS自由基的反应动力曲线Figure 2 Kinetic curves of scavenging effects of different concentrations of PQQH2 on ABTS radical

对不同质量浓度PQQH2清除ABTS自由基反应进行准一级、准二级动力学方程拟合，结果见图3、图4，相应动力学参数见表1。准一级动力学模型拟合相关系数均在0.9以下，线性相关较差。而准二级动力学模型拟合的线性相关系数为0.959～0.996，因此，PQQH2清除ABTS自由基采用准二级动力学模型，二级反应速率常数随PQQH2质量浓度的增加而增大。二级反应速率常数能够反映抗氧化物质的自由基清除能力，其值越大，清除自由基的能力越强。

表1 动力学模型拟合参数Table 1 Kinetic parameters for PQQH2 to ABTS·

图3 PQQH2清除ABTS自由基准一级反应动力学方程的拟合图线Figure 3 Fitting curve of the kinetic equation of the quasi-first order reaction of PQQH2 clearing ABTS radical

图4 PQQH2清除ABTS自由基准二级反应动力学方程的拟合图线Figure 4 Fitting curve of the kinetic equation of the quasi-second order reaction of PQQH2 clearing ABTS radical

2.2 清除ABTS自由基的IC50值

如图5所示，ABTS自由基清除率与PQQH2和维生素C在一定质量浓度范围内呈线性关系，ABTS自由基清除率与PQQH2、维生素C的质量浓度呈正比。当PQQH2质量浓度为0～90 mg/L时，对ABTS自由基的清除率随着质量浓度的增大而升高，清除率可高达95%左右，但之后随着PQQH2质量浓度的增加，清除率虽然也在增加，但增长速率显著降低，清除率最终保持平稳不变。PQQH2清除ABTS自由基IC50值约为30 mg/L，即90 μmol/L，而维生素C清除ABTS自由基的IC50值约为38 mg/L，即176 μmol/L。PQQH2的IC50值是维生素C的51.14%，说明PQQH2比维生素C更适合作为一种快速清除自由基的抗氧化剂。

图5 PQQH2、维生素C对ABTS自由基清除能力的变化Figure 5 ABTS radical scavenging capacity of PQQH2,VC

2.3 PQQH2与维生素C清除ABTS自由基的反应动力学比较

通过研究相同质量浓度(70 mg/L)的PQQH2与维生素C清除ABTS自由基的反应动力学，结果见图6。由图6 可知，相同质量浓度时，PQQH2的抗氧化性要高于维生素C的。反应25 min时，PQQH2对ABTS自由基的清除率可达到90%以上，而维生素C对ABTS自由基的清除率仅能达到78%。

图6 PQQH2和维生素C清除ABTS自由基的反应动力曲线Figure 6 Kinetic curves of scavenging effects of PQQH2 and VC on ABTS radical

2.4 热稳定性研究

2.4.1 加热温度对PQQH2稳定性的影响 如图7所示，在加热时间相同的条件下，随着加热温度的升高，PQQH2和维生素C对ABTS自由基的清除能力均呈下降趋势，可能是由于加热导致抗氧化活性基团损失。加热温度由30 ℃升高到100 ℃，相同质量浓度的维生素C对ABTS自由基清除能力损失比PQQH2多2～3倍。说明PQQH2表现出的热稳定性要高于维生素C，当加热时间相同时，PQQH2的稳定性更高，对ABTS自由基清除能力损失更小，PQQH2即使在高温条件下，也依然能够保持自身结构的稳定性，从而展现突出的抗氧化特性。

图7 加热温度对清除率的影响Figure 7 The effect of heating temperature on removal rate

2.4.2 加热时间对PQQH2稳定性的影响 如图8所示，当加热温度一定，随着加热时间的延长，维生素C表现出的抗氧化活性能力的降低幅度显著高于PQQH2，约为PQQH2的3～7倍。相较于维生素C，PQQH2具有稳定的结构，在高温条件下，依然能够保持优良的抗氧化性能。维生素C因其具备的抗氧化特性被广泛应用于食品中，但基于自由基清除能力、热稳定性等指标，PQQH2比维生素C更适合作为食品抗氧化剂。

图8 加热时间对清除率的影响Figure 8 Effect of heating time on removal rate

3 结论

研究检测了10，30，50，70 mg/L 4种质量浓度下还原态吡咯喹啉醌对ABTS自由基的清除能力，结果表明，浓度越高，清除能力就越强。当还原态吡咯喹啉醌的质量浓度为70 mg/L时，反应25 min，ABTS自由基的清除率可达到90%以上，说明还原态吡咯喹啉醌具有一定的抗氧化能力。根据反应动力学模型，二级动力学拟合方程更能描述还原态吡咯喹啉醌对ABTS自由基的清除能力，相关系数为0.959～0.996。还原态吡咯喹啉醌比维生素C具有更好的抗氧化活性，有望将其开发为一种天然的抗氧化剂。