滤泡细胞毒性T 细胞在非肥胖糖尿病小鼠免疫损伤进程中的作用研究

严婕妮，许馨予，李 欣，杨 涛

南京医科大学第一附属医院内分泌科，江苏 南京 210029

1型糖尿病（type 1 diabetes，T1D）是一种由环境因素、基因组、代谢与自身免疫系统之间相互作用而引发的，以T 细胞介导胰岛β细胞破坏，从而导致胰岛素分泌减少或胰岛素绝对缺乏为特征的慢性自身免疫性疾病［1］。其免疫学发病机制主要是活化的B细胞与CD4+和CD8+T细胞的相互作用。基因易感性和病毒感染等环境因素导致带有β细胞抗原肽的B细胞抗原递呈，驱动了自身反应性CD4+T细胞的激活，进而介导CD8+T细胞的活化。活化的CD8+T细胞返回胰岛，通过释放穿孔素和颗粒酶以接触依赖性方式杀伤胰岛β细胞。胰岛β细胞损伤后不断释放胰岛自身抗原，诱导自身反应性CD4+和CD8+T细胞对胰岛的进一步攻击，最终导致胰岛β细胞衰竭引起T1D的发生。因此CD8+T细胞是T1D发生和进展的关键［2］，而胰岛炎或免疫浸润胰岛则是该疾病的标志性病理学特征［3-4］。

滤泡细胞毒性T 细胞（follicular cytotoxic T cells，TFC）是一种特异性表达CXCR5+的CD8+T细胞亚群（即CXCR5+CD8+T细胞），它可以抑制B细胞滤泡中病原体感染细胞，也可能有助于记忆性特异性效应细胞毒性CD8+T 细胞（cytotoxic T cells，TC）的发育［5］。TC由机体感染后的抗原特异性CD8+T细胞在次级淋巴器官的T 细胞区中分化而成，其目的是为了清除感染细胞［6-7］。TFC的比例在慢性感染（如淋巴感染）中尤其高，TFC 通过CXCR5 转录调节迁移至B细胞滤泡，表达低水平的抑制性受体，并且比CXCR5-CD8+T细胞表现出更强的细胞毒性，在滤泡中发挥着清除病毒感染细胞的作用［8］。在肿瘤相关研究中发现，TFC在肿瘤组织和肿瘤相关淋巴结中富集，且在体外比CXCR5-CD8+T细胞更有效地介导肿瘤细胞死亡，具有抗肿瘤免疫的潜能［9-11］。目前，对TFC的探索主要集中在慢性感染及肿瘤，在自身免疫性疾病中对这群细胞的表型、功能、来源、产生的机制以及与其他细胞之间的相互作用的研究少之又少。因此，基于TFC的既往研究结果，本文推测TFC在胰岛炎进程中和T1D的致病环节或存在一定关联。

非肥胖糖尿病（non⁃obese diabetic，NOD）小鼠因其遗传复杂性、对特定主要组织相容性复合体Ⅱ（major histocompatibility complex Ⅱ，MHC Ⅱ）类等位基因的易感性等方面近似于人类T1D，而成为研究T1D 最主要的动物模型［12-13］。因此在本研究中，选取NOD小鼠作为研究对象，通过观察TFC在不同周龄NOD 小鼠的不同组织中的表达量及其表达脱颗粒标记物白细胞分化抗原（cluster of differentia⁃tion 107a，CD107a）和重组人杀伤细胞凝集素样受体G亚族成员1（recombinant human killer cell lectin⁃like receptor subfamily G，member 1，KLRG1）、抑制性分子程序性死亡分子1（programmed cell death pro⁃tein 1，PD⁃1）和T细胞免疫球蛋白黏蛋白结构分子3（T cell immunoglobulin mucin 3，TIM⁃3）的表达水平，以及其分泌干扰素γ（interferon γ，IFN⁃γ）、颗粒酶B（granzyme B，GzmB）的能力，初步发掘与探讨TFC与T1D之间存在的关联。

1 材料和方法

1.1 材料

雌性NOD小鼠（4～25周龄），购买于南京大学模式动物研究所。NOD 小鼠均在南京医科大学动物中心无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级环境中喂养。此次实验中所有的过程及操作均遵守实验动物管理条例，符合南京医科大学实验动物福利伦理审查委员会的规范，并获得伦理会的批准（IACUC 14030143⁃2）。

抗鼠APC/Cy7 CD3 抗体、抗鼠PerCP/Cy5.5 CD8a 抗体、抗鼠PE CD185（CXCR5）抗体、抗人/鼠Alexa Fluor700 CD44 抗体、抗鼠APC CD279（PD⁃1）抗体、抗鼠APC CD336（TIM⁃3）抗体、抗鼠APC CD107a 抗体、抗人/鼠APC KLRG1 抗体、抗人/鼠FITC Granzyme B 抗体、抗鼠Brilliant Violet 421 IFN⁃γ抗体（Biolegend公司，美国）。

NaCl（汕头市西陇化工厂有限公司），KCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4·12H2O、KHCO3、NH4Cl、EDTA（上海凌峰化学试剂有限公司），胎牛血清（Gibco 公司，美国），RPMI 1640 培养基、青霉素⁃链霉素双抗（Thermo Fisher Scientific公司，美国）。

FACS Calibur 流式细胞仪、FACS Aria 流式细胞仪、流式专用试管（BD 公司，美国），血糖仪、血糖试纸（TERUMO公司，日本），15 mL离心管、50 mL离心管（Corning公司，美国），细胞培养箱、落地高速离心机（Thermo Fisher Scientific公司，美国），生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司），涡振荡器IKA Vor⁃tex Genius 3（IKA公司，德国）、移液器（1 mL/200 μL/50 μL/10 μL/2.5 μL）（Dragonmed公司，芬兰）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组

选取4、10、15、20、25周龄及高血糖（hyperglyce⁃mia，Hi）组NOD小鼠经过标准饲料喂养10周后，每周测量血糖，2次重复血糖值＞16.7 mmol/L被认为是显性糖尿病（即高血糖组），随机分成6组，每组6～10只。

1.2.2 脾脏、淋巴结和胸腺组织分离

提前准备好培养皿，皿内铺置一张200 目尼龙滤膜并提前加入5 mL 缓冲液（Adding Buffer）（99%PBS 缓冲液加上1%胎牛血清），将皿放置于冰盒内。将每组NOD 小鼠摘除眼球放血，颈部脱臼处死，并置于75%乙醇中浸泡数分钟，之后将NOD 小鼠固定于解剖操作台上（提前将固定针、眼科剪、镊子浸泡于75%乙醇中数分钟），无菌分离摘取小鼠脾脏、淋巴结（腹股沟、腋下、肠系膜、腹主动脉旁处引流淋巴结）、胸腺。将取出的器官组织放入提前准备好的培养皿中。

在脾脏、淋巴结、胸腺上分别覆盖一层200 目滤膜，用5 mL 无菌注射器末端研磨，将研磨液吸入15 mL 离心管中，再用5 mL Adding Buffer 液冲洗滤膜，同时将冲洗液也移入离心管中。将离心管置于离心机水平转子中，经4 ℃、1 500 r/min离心5 min，弃上清，重悬细胞。将重悬后的细胞加入Adding Buffer定容至1 mL细胞悬液，加入10 mL红细胞裂解液（1×），将离心管于冰上静置5 min 后，4 ℃、1 500 r/min 离心5 min。弃上清，重悬细胞并加入10 mL Adding Buffer 洗涤细胞1 次。弃上清，用1mL Adding Buffer重悬细胞并经200目尼龙滤膜将细胞悬液过滤（以除去细胞碎片）至另一15 mL离心管中。经显微镜下细胞计数并取2×106个细胞，用于流式抗体标记及检测。

1.2.3 细胞表面流式抗体标记染色

取分离好的脾脏、淋巴结、胸腺组织的细胞2×106个分别置于流式管中，取适量流式荧光抗体进行细胞染色，加入1.25 μL 抗鼠CD3⁃APC/Cy7 抗体、1.25 μL 抗鼠CD8a⁃PerCP/Cy5.5 抗体，1 μL 抗鼠CD185（CXCR5）⁃PE 抗体、0.5 μL 抗鼠/人CD44⁃Al⁃exa Fluor 700 抗体，震荡混匀，再分别加入抗鼠CD279（PD⁃1）⁃APC抗体、抗鼠CD107a⁃APC抗体、抗鼠KLRG1⁃APC 抗体、抗鼠TIM3⁃APC 抗体各1 μL，震荡混匀。4 ℃避光静置15 min。加3 mL PBS重悬细胞，4 ℃、1 500 r/min 离心5 min。弃上清，并加入200 μL PBS 重悬细胞。最后将样品置于流式细胞仪中上机检测。

1.2.4 细胞胞内因子流式抗体标记染色

配制刺激剂：1640 完全培养基+75 ng/mL 佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）+1 μg/mL 离子霉素（Ionomycin）+10 μg/mL 布雷非德菌素A（Brefeld⁃in A，BFA）。取分离好的脾脏、淋巴结、胸腺组织的细胞2×106个分别置于流式管中，每管加入1 mL 提前配制好的刺激剂，置于5%CO2的37 ℃恒温恒湿培养箱中刺激5～6 h。刺激结束后，加入3 mL Add⁃ing Buffer，4 ℃、1 500 r/min 离心5 min。弃上清，避光条件下加入1.25 μL 抗鼠CD8a⁃PerCP/Cy5.5 抗体。震荡混匀。4 ℃避光静置15 min。加3 mL Add⁃ing Buffer重悬细胞，4 ℃、1 500 r/min离心5 min。弃上清，加入100 μL破膜剂A，重悬后，室温避光静置15 min。加3 mL Adding Buffer 重悬细胞，4 ℃、1 500 r/min 离心5 min。弃上清，加入100 μL 破膜剂B，3 μL 抗人/鼠Granzyme B⁃FITC 抗体、0.5 μL 抗鼠IFN⁃γ⁃Brilliant Violet 421 抗体。震荡混匀。4 ℃避光静置30 min。加入3 mL Adding Buffer 重悬细胞，1 500 r/min，温度4 ℃的条件离心5 min，弃去上清，并加入200 μL Adding Buffer 重悬细胞。最后将样品置于流式细胞仪中上机检测。

1.3 统计学方法

应用FlowJo vX.0.7流式分析软件分析流式结果；使用GraphPad Prism 7.0做图软件进行图形处理。涉及的统计学方法包括t检验、单因素方差分析（组间比较前均进行正态性检验和方差齐性检验，不满足正态分布或方差齐性则使用非参数检验方法）、多重假设检验。多组间比较使用Kruskal⁃Wallis 检验。实验均独立重复3次，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TFC在NOD小鼠脾脏、淋巴结细胞比例远高于胸腺

为了观察TFC 在NOD 小鼠中不同免疫器官间的分布是否存在差异，分别取小鼠脾脏、淋巴结（包括胰腺周围引流淋巴结、腹股沟淋巴结、腋窝淋巴结、腹主动脉旁淋巴结）和胸腺组织，提取组织中的淋巴细胞。参考慢性感染和癌症研究中对TFC 表型的探究，选定CD3、CD8、CD44、CXCR5 为本研究中TFC 的抗体标记，染色后进行流式细胞检测，CD3+CD8+CD44+CXCR5+T细胞即为TFC（图1A）。实验结果表明，TFC 分布存在组织差异，在NOD 小鼠脾脏、淋巴结中的细胞比例较高，且脾脏中的表达量略高于淋巴结，但未达到统计学差异（各组P＞0.05，图1B）。TFC在胸腺中几乎无表达。这一结果提示，TFC主要存在于NOD小鼠的脾脏和淋巴结中，可能参与了NOD小鼠自身免疫性糖尿病的进展。

图1 TFC在NOD小鼠不同免疫器官中的分布比例Figure 1 Proportion and distribution of TFC in different immune organs of NOD mice

2.2 发生高血糖前TFC 细胞比例随NOD 小鼠周龄延长而增高

为观察NOD 小鼠自身免疫性糖尿病自然病程的不同阶段及发病后TFC 的细胞比例在脾脏和淋巴结中的变化，分别选取了4、10、15、20、25 周及高血糖组（Hi）NOD小鼠，分别代表自身免疫性糖尿病胰岛炎由轻到重的不同阶段，以及糖尿病发病的不同疾病进程。将各组小鼠的脾脏和淋巴结分离出来，取其淋巴细胞并进行流式染色，流式图中CD44+CXCR5+细胞群为CXCR5+CD8+T 细胞（即TFC），CD44+CXCR5-细胞群为CXCR5-CD8+T细胞，以此观察2种细胞比例的变化（图2A、C）。实验结果表明，与CXCR5-CD8+T 细胞相比，TFC 的细胞比例，无论是在脾脏（4、10、15、20、25 周组、Hi 组，P＜0.000 1，图2B）还是在淋巴结（4、20、25 周组、Hi 组，P＜0.001；10周组，P＜0.05；15周组，P＜0.01，图2D）中均明显较低，仅占总CD8+T 细胞比例的3%～10%。在NOD 小鼠发病前，随着小鼠周龄延长、胰岛炎程度的加重，TFC细胞比例呈现逐渐增高趋势，但是在小鼠发生高血糖后，TFC细胞比例在脾脏（4周组vs.25周组，P＜0.01；4周组vs.Hi组，P＜0.05，图2B）和淋巴结（4周组vs.25周组，P＜0.000 1；10周组vs.25周组，P＜0.01；15 周组vs.25 周组，P＜0.001；20 周组vs.25 周组，P＜0.001；25 周组vs.Hi 周组，P＜0.01，图2D）中均有下降。这一结果提示，TFC 确实参与了NOD小鼠自身免疫性糖尿病的自然病程，并且根据先前其他研究的结果，推测TFC对淋巴细胞发挥着促炎和细胞毒性的作用，介导了胰岛β细胞的破坏，推动了糖尿病的发病。

图2 不同组NOD小鼠脾脏和淋巴结中TFC（CXCR5+CD8+T细胞）和CXCR5-CD8+T细胞比例变化Figure 2 Changes in the proportion of TFC（CXCR5+CD8+T cells）and CXCR5-CD8+T cells in the spleen and lymph nodes of NOD mice of different groups

2.3 TFC 表达多种脱颗粒、抑制性标记物，且标记物表达水平均高于CXCR5-CD8+T细胞亚群

为进一步探究TFC 的细胞表型以及其可能发挥的功能，根据在慢性感染和肿瘤中对TFC的既往研究成果，选取了表面标记物CD107a、KLRG1、PD⁃1和TIM⁃3，对4、10、15、20、25 周及Hi 组NOD 小鼠的脾脏淋巴细胞进行流式染色分析。虽然CXCR5+CD8+T 细胞（即TFC）的细胞比例明显低于CXCR5-CD8+T 细胞亚群，但通过检测2 种细胞亚群表达的脱颗粒标记物CD107a、KLRG1和抑制性分子PD⁃1、TIM⁃3，发现相较于CXCR5-CD8+T细胞亚群，TFC上的CD107a（4、10、20 周组，P＜0.05；15、25 周组、Hi组，P＜0.01，图3A）、PD⁃1（15 周组、Hi 组，P＜0.05；25 周组，P＜0.01，图3C）、TIM⁃3（15 周组，P＜0.05；25 周组、Hi 组，P＜0.01，图3D）呈现明显高表达，且差异具有统计学意义。虽然KLRG1在2种细胞上均有表达，但KLRG1表达量仅在25周小鼠中有明显差异（25周组，P＜0.01，图3B）。这一结果印证了先前的推测，TFC 的脱颗粒分子呈高表达，表明这种细胞发挥的细胞毒性效应显著强于CXCR5-CD8+T 细胞。与此同时，TFC高表达PD⁃1和TIM⁃3，说明相较于CXCR5-CD8+T细胞，TFC具有显著的“耗竭”表型。

图3 TFC（CXCR5+CD8+T细胞）与CXCR5-CD8+T细胞亚群表达CD107a（A），KLRG1（B），PD⁃1（C）和TIM⁃3（D）标记物的比例Figure 3 The levels of CD107a（A），KLRG1（B），PD⁃1（C）and TIM⁃3（D）markers expressed by TFC（CXCR5-CD8+ T cells）and CXCR5-CD8+T cell subsets

2.4 TFC 释放IFN⁃γ和GzmB 的能力强于CXCR5-CD8+T细胞

在慢性感染和肿瘤中的研究表明，CXCR5+CD8+T细胞（即TFC）在面对病毒感染和肿瘤细胞侵袭时发挥着独特的细胞毒性作用，前期研究结果也发现，TFC 携带的脱颗粒分子CD107a呈高表达。为进一步证实TFC在NOD小鼠中是否也发挥着强烈的细胞毒杀伤作用，我们将10周龄的NOD小鼠脾脏的淋巴细胞分离出来，经PMA、Ionomycin、BFA处理后在5%CO2，37 ℃恒温恒湿培养箱中刺激5～6 h后，破膜进行流式染色，检测TFC及CXCR5-CD8+T细胞亚群中IFN⁃γ和GzmB的分泌水平。实验结果表明，TFC与CXCR5-CD8+T 细胞相比，具有更强地释放GzmB（TFC：3.56%±2.1%；CXCR5-CD8+T 细胞：0.78%±0.39%，P＜0.05，图4A）和IFN⁃γ（TFC：43.65%±12.25%；CXCR5-CD8+T 细胞：21.92%±3.72%，P＜0.05，图4B）的能力。这一结果提示，TFC具有更强的促炎及细胞毒性作用，也进一步证实了我们的猜想，TFC在自身免疫性糖尿病进程中发挥着细胞毒性作用，破坏胰岛β细胞，促进疾病进展。

3 讨论

T1D 是由致病性T 细胞参与介导的针对胰岛β细胞自身免疫性疾病。其免疫损伤的核心机制是，胰岛自身抗原被抗原递呈细胞（antigen presenting cell，APC）加工处理后递呈给CD4+T细胞致其活化，活化的CD4+T 细胞分泌大量细胞因子的同时，活化并辅助CD8+T细胞杀伤破坏胰岛β细胞。随后胰岛细胞内抗原释放并暴露，特异性B 淋巴细胞产生胰岛自身抗体。因此，CD8+T 细胞在T1D 的发病机制中起至关重要的作用，而阻止CD8+T 细胞进行免疫攻击成为T1D免疫治疗的关键方向。

2007年，Quigley等［14］在人外周血和扁桃体B细胞的卵泡中发现了一群CXCR5+CD8+T细胞，起着早期效应记忆性T细胞的作用。近些年，在对CXCR5+CD8+T细胞的不断研究中，人们对这群细胞独特的表型、功能、分化方式有了更加深入的了解［15］。在有关小鼠淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒（latency of maximal pupil contraction velocity，LCMV）感染的研究中发现，有大量CXCR5+CD8+T 细胞进入B 细胞滤泡，并且在免疫荧光显微镜下观察到CXCR5 在小鼠刺激淋巴器官的滤泡和滤泡周CD8+T 细胞中表达［5，8，16］。因此，CXCR5+CD8+T细胞被称为TFC。已有研究表明，TFC在健康人群外周血CD8+T细胞中约占2%［14］，并能够浸润分布于肺脏、胰腺和结直肠的肿瘤组织中，并且在肿瘤中的比例高于血液［11，17-18］。本项研究首先探索了TFC 在NOD 小鼠外周免疫器官的分布情况及比例，发现TFC 在脾脏和淋巴结中分布较高，占总CD8+T细胞比例的3%～10%，且在脾脏中的比例略高于淋巴结（P＞0.05）。而TFC在NOD小鼠胸腺中几乎没有表达。在具有免疫缺陷的人源化非肥胖糖尿病/合并严重免疫缺陷/白介素2受体γ链缺失小鼠（humanized non⁃obese diabetic/severe combined immune deficiency/interleukin⁃2 receptor γ⁃chain null，huNSG）中，TFC 在脾脏和淋巴结中约占10%［19］，本研究结果与之相似，这一结果也证实了TFC存在于NOD小鼠免疫器官内，并有可能参与了自身免疫性糖尿病的进程。

图4 CXCR5+CD8+T细胞（即TFC）与CXCR5-CD8+T细胞释放的GzmB（A）及IFN⁃γ（B）水平Figure 4 GzmB（A）and IFN⁃γ（B）levels released by CXCR5-CD8+T cells（TFC）and CXCR5-CD8+cell subsets

近年来，与TFC 相关的慢性感染及肿瘤研究已经证实TFC 行使的3 大主要功能［15］：①发挥细胞毒作用，在B 细胞卵泡中进行免疫监视以消除感染的细胞和癌细胞，因此TFC 可以协助滤泡辅助性T 细胞（follicular helper T cells，Tfh）清除艾滋病病毒（hu⁃man immunodeficiency virus，HIV）［20］、猿猴免疫缺陷病毒（Simian immunodeficiency virus，SIV）感染［21-22］；②具有自我更新能力，能逆转细胞“耗竭”状态，面对长时间的抗原暴露（例如在慢性病毒感染或某些癌症中）能够维持细胞免疫力［5，8］；③具有双向调节自身抗原抗体反应的潜力［23-24］。为进一步印证具有细胞毒性作用的TFC 参与了自身免疫糖尿病的自然进程，检测了4、10、15、20、25周及Hi组NOD小鼠的TFC 及CXCR5-CD8+T 细胞亚群的比例。研究结果显示，无论在淋巴结还是在脾脏中，与CXCR5-CD8+T细胞相比，TFC的细胞比例明显较低，并且在发病前随着NOD小鼠周龄延长，TFC比例呈现逐渐增高趋势，但是在NOD 小鼠发生高血糖后，TFC 比例出现下降。这一结果提示TFC 参与了NOD 小鼠的自然病程，并且在NOD小鼠免疫损伤不断加重且发展为T1D 的过程中维持着越来越高的比例，以及持续性的浸润。Insel 等［25］拟建了一个T1D 从疾病前状态到发病的分期示意图，该示意图表示T1D 受遗传和环境风险的影响［26］，在尚未出现糖尿病症状但血糖已经异常的情况下，β细胞自身抗原不断暴露导致自身抗体的数量不断增加。胰岛β细胞受到免疫攻击数量减少加之表位抗原与越来越多的抗体相结合，导致血糖升高后持续的抗原刺激减少，从而导致由持续性抗原刺激产生的TFC 的细胞比例下降，我们认为这一过程能够解释高血糖组NOD小鼠无论在脾脏还是淋巴结中，TFC 的细胞比例均降低这一现象。

由于持续性的抗原暴露，抗原特异性CD8+T 细胞逐渐失去增殖、分泌细胞因子的能力，PD⁃1、TIM⁃3、淋巴细胞激活基因3（lymphocyte activation gene 3，LAG⁃3）、2B4（CD244）等抑制性受体的表达增加预示着细胞进入“耗竭”状态［27-28］。Im 等［16］研究表明，从LMCV 感染小鼠体内分离出的CXCR5+CD8+T细胞（即TFC）表达低水平的抑制性分子，且这种减弱的“耗竭”表型更有利于控制病毒感染。本研究也对TFC 及CXCR5-CD8+T 细胞的脱颗粒标记物CD107a、KLRG1 及免疫抑制性分子PD⁃1、TIM⁃3 的表达量进行了分析。CD107a和KLRG1均是自然杀伤（natural killer cell，NK）细胞和活化的CD8+T 细胞脱颗粒的标记物，已有研究表明这2 种分子通过释放GzmB、IFN⁃γ和肿瘤坏死因子α等分子发挥其细胞毒性作用［29-31］。本研究结果显示，脱颗粒标记物CD107a 表达量在CXCR5-CD8+T 细胞群中几乎无表达，而在TFC 中表达量显著高于CXCR5-CD8+亚群，KLRG1在2种细胞中均有表达但比例在两者间没有显著差异。与此同时，检测了2 种细胞中IFN⁃γ和GzmB 的分泌水平，发现相较于CXCR5-CD8+T 细胞亚群而言，TFC具有更强的释放GzmB和IFN⁃γ的能力。表达高水平的脱颗粒标记物和高水平的IFN⁃γ和GzmB的分泌能力均提示着TFC具有更强的促炎及细胞毒性作用。KLRG1虽在TFC及CXCR5-CD8+T细胞均有表达，但其比例在2组细胞间没有显著差异，因此认为KLRG1在T1D进展中确实发挥了细胞毒性作用，但不是区分TFC与CXCR5-CD8+T细胞的标志性表面分子。TIM⁃3是一种Ⅰ型膜表面蛋白分子，具有免疫球蛋白和黏蛋白样结构域。研究证实，阻断TIM⁃3 途径可以通过上调辅助性T 细胞1（T helper cell 1，Th1）依赖性免疫应答，抑制免疫耐受，促进NOD 小鼠自身免疫性糖尿病发展［32⁃33］。同样的，PD⁃1作为目前肿瘤免疫检查点疗法中炙手可热的靶点，其PD⁃1/PD⁃1 配体通路的阻断一方面能减轻肿瘤中的T 细胞浸润，另一方面则会引起胰岛白细胞浸润促进自身免疫性糖尿病的发展［34-35］。本研究中NOD 小鼠脾脏TFC表面抑制性分子PD⁃1和TIM⁃3的表达水平明显高于CXCR5-CD8+亚群，这一结果与前面提到的研究结果相一致，意味着TFC 在NOD 小鼠自身免疫性糖尿病自然病程中也携带着这种“耗竭”表型。但是在T1D疾病进程中，到底是脱颗粒标记物发挥的细胞毒性作用强还是抑制性分子的“耗竭”表型占主导还需进一步探究，TFC作用途径的探究将为T1D 免疫检查点封锁疗法提供新思路。

综上所述，本研究发现TFC存在于NOD小鼠脾脏和淋巴结中，胸腺中几乎不分布。在发生高血糖前，其比例随着NOD 小鼠免疫损伤进展而不断增高，而一旦发病，TFC 比例出现下降。相较于CX⁃CR5-CD8+T细胞，其脱颗粒标志物CD107a呈显著性高表达，同时TFC 释放IFN⁃γ和GzmB 能力强，均提示着TFC参与了T1D的自然病程且通过细胞毒性作用促进NOD 小鼠的免疫损伤。TFC 的抑制性分子PD⁃1、TIM⁃3呈现高表达，说明TFC这种细胞携带着“耗竭”表型。在未来的研究中，将进一步完善TFC相关功能验证实验，并且探索TFC 细胞在T1D 患者中的分布情况及作用机制，从而进一步探寻TFC 与T1D的关联。