不同生长年限霍山石斛抗炎和抗肿瘤作用比较研究

张 笑，李志强，岳 芹，邹艳敏，欧阳臻，韩邦兴，魏 渊* *

(1. 江苏大学 药学院，江苏 镇江 212013； 2. 安徽省中药资源保护与持续利用工程实验室，安徽 六安 237012； 3. 皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237012； 4. 皖西学院 金融与数学学院，安徽 六安 237012 )

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)俗称米斛，是兰科石斛属的草本植物，主产于大别山区的安徽省霍山等地区。霍山石斛的植株矮小，长3～9 cm，茎直立由下向上逐渐变细，呈圆锥状，形似米粒，花呈淡黄绿色，具有独特的地理分布、形态特征、遗传结构及药理活性[1-2]。《本草正义》中记载“若老人虚人，胃液不足，而不宜大寒者，则霍山石斛为佳。”[3]。现代研究表明，霍山石斛含有石斛多糖、生物碱、酚酸、微量元素、氨基酸等多种药用成分[4-7]，具有抗氧化、抗炎、抗肝损伤、抗肿瘤及抗疲劳等药理作用[8-12]。

霍山石斛具有良好的抗炎作用，有研究报道以脂多糖诱导的RAW264.7细胞为炎症模型，观察霍山石斛多糖的抗炎作用，发现霍山石斛多糖能抑制炎症细胞炎症因子的表达，并且半仿生提取方法得到的霍山石斛多糖抗炎作用更佳[13]。霍山石斛的抗炎作用与TNF-α、IL-1、IL-2、IL-1b和IFN-γ等炎症因子的降低相关[14-16]，且与抑制NF-κB、MAPK及Akt通路的活化有关[17]。

霍山石斛也具有一定的抗癌活性，可抑制胃癌细胞的增殖，其机制与c-myc基因和p53基因的表达有关[18-19]。同时，霍山石斛能抑制荷宫颈癌小鼠肿瘤组织的生长，抗癌机制与细胞因子IFN-γ和CD8 +T细胞的活性相关[20]。鲍丽娟等[21]研究发现霍山石斛水提物对人宫颈癌HelaS3细胞和肝癌HepG2细胞均有不同度的抑制作用。

由于野生霍山石斛的生长条件苛刻，且对湿度和光照的要求很高，自然繁殖率低，加上过度采摘，导致野生霍山石斛濒临灭绝[22]。目前人工栽培霍山石斛已逐渐代替野生霍山石斛，其采收期多为每年的秋冬季。然而鲜有不同生长年限的霍山石斛成分含量与药效的差异报道，开展霍山石斛采收期相关研究可保障药材质量，促进霍山石斛产业化发展。《中国药典》2020年版对霍山石斛采收期做出规定，为每年的11月至翌年的3月采收，但并未对采收年限做出要求。中药材的化学成分复杂，中药产生的疗效并非某一种成分的单独作用效果，而是多组分、多靶点之间共同作用，因此药材的采收期将直接影响药材的药效。多糖为石斛类药材含量较多的成分之一，其合成过程受到多种酶的影响，例如磷酸葡糖异构酶、GDP-葡萄糖焦磷酸化酶、蔗糖合成酶和淀粉合成酶等[23-24]，多糖的积累与种质、产地、生理年龄等因素有关[25-27]。次生代谢产物的合成途径多样，遗传、环境以及激素调控等因素都可能影响其含量，次生代谢产物的积累与药材质量密切相关，是保证药材安全、有效、稳定的基础[28-30]。

通过研究不同生长年限药材的物质成分含量，可以对不同生长年限药材整体化学成分进行分析比较，结合药效物质基础及整体药用价值，可为药材的采收期提供更明确的指导。已有不少关于生长年限影响药材药效成分的研究。彭焱等[31]研究不同生长年限(2年和3年)的白及5种药效成分含量差异，综合其药用部位(块茎)产量与药效成分含量考虑,建议白及采收以其生长年限3年及以上为宜。夏琴等[32]发现不同产地、不同商品规格及生长年限猪苓药材中麦角甾醇及多糖的含量存在较大差异，麦角甾醇以四年生猪苓样品含量最高。薛雪等[33]发现不同生长方式及年限的防风饮片外观性状、内在质量和疗效有明显差异，并呈现野生防风优于多年生栽培防风优于一年生栽培防风的变化规律。

研究不同生长年限霍山石斛活性成分多糖、黄酮、生物碱和石斛酚的含量差异，通过二甲苯致小鼠耳肿胀试验探究不同生长年限霍山石斛的抗炎作用。还比较了不同生长年限霍山石斛对HeLa细胞增殖的抑制作用，为霍山石斛采收年限提供更充足的依据，并为霍山石斛抗炎药效的探究及在肿瘤防治中的应用提供基础。

1 试验材料

1.1 试验动物及细胞

试验选取健康的八周龄SPF级C57BL/6小鼠，80只，雄性，体重20±2 g，购自江苏大学试验动物中心(动物许可证号：SCXK(苏)2018-0053)。12 h明暗交替周期饲养，自由进食和饮水，购买后正常适应性饲养一周用于试验。

试验细胞为人宫颈癌HeLa细胞(批号：CBP60232)，购自中科院上海细胞库。

1.2 药物与试剂

霍山石斛(D.huoshanense)由皖西学院韩邦兴教授提供和鉴定。

芦丁(北京中科质检生物技术有限公司，批号：180324)；石斛酚(北京中科质检生物技术有限公司，批号：180924)；石斛碱(北京中科质检生物技术有限公司，批号181226)；无水葡萄糖(国药集团化学试剂有限公司，批号：20180620)；胎牛血清(美国Gibco公司)；胰酶消化液(碧云天生物技术公司)；青霉素、链霉素(美国Sigma公司)；5-FU(上海阿达玛斯试剂有限公司)；CCK-8试剂盒(碧云天生物技术公司)；DMEM 培养基(以色列Biological Industries公司)；二甲苯(国药集团化学试剂有限公司)；地塞米松(浙江仙琚制药有限公司)。

1.3 主要仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪，Agilent Eclipse plus C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm )色谱柱(美国Agilent公司)；Spectra Max 190型酶标仪(美国MD公司)；SK-1快速混匀器(江苏中大仪器厂)；TE601-L电子天平(北京Sartorius仪器系统有限公司)；Pic017台式离心机(美国Thermo Fisher公司)；Model 754型紫外分光光度计(上海现科仪器有限公司)；3111 CO2孵箱(美国Thermo公司)；1300 SERIES A2超净工作台(美国Thermo公司)；TS110倒置显微镜(日本Nikon公司)；BSA1245电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；7mm耳肿胀打孔器(上海泰坦科技股份有限公司)；BuchiR-200型旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)；SHB-III循环水多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)。

2 方 法

2.1 霍山石斛榨汁液及水提物的提取

霍山石斛榨汁液的制备：将石斛新鲜茎的杂质去除，洗净，剪成小段，称取10 g放入榨汁机中榨汁，滤布过滤，定容至100 mL，-80℃冰箱保存备用。

霍山石斛水提物制备方法为：精密称取不同生长年限霍山石斛粉末各5 g，加水200 mL，加热回流2 h，趁热过滤，浓缩后冻干得不同生长年限霍山石斛水提物。

2.2 不同生长年限霍山石斛抗炎作用

2.2.1 分组及给药

将 C57BL/6小鼠随机分为8组，每组10只，分别为空白对照组、阳性组、一年生霍山石斛低剂量组(生药1.25 g·kg-1，参照《中国药典》石斛用量)、一年生霍山石斛高剂量组(生药7.5 g·kg-1)、二年生霍山石斛低剂量组(含生药1.25 g·kg-1)、二年生霍山石斛高剂量组(生药7.5 g·kg-1)、三年生霍山石斛低剂量组(生药1.25 g·kg-1)和三年生霍山石斛高剂量组(生药7.5 g·kg-1)。各给药组连续灌胃给药7 d，每24 h灌胃给药，空白对照组给予等量的生理盐水，阳性对照组给予5 mg·kg-1地塞米松。

2.2.2 二甲苯诱导小鼠耳肿胀

末次给药1 h后，用移液枪在小鼠右耳的耳中部两侧均匀滴30 μL二甲苯致炎，左耳不做处理作为空白对照，1 h后将小鼠CO2窒息法处死，用打孔器将小鼠两耳重叠打孔，精密称量，计算肿胀度和肿胀抑制率。

肿胀度=右耳重量-左耳重量

2.3 不同生长年限霍山石斛抗肿瘤作用

2.3.1 试验细胞分组

试验分为阳性对照组(5-FU，50 μg·mL-1)、空白对照组、浓度分别为(2、4、6、8、10 mg·mL-1)的一年生霍山石斛水提物组、浓度分别为(2、4、6、8、10 mg·mL-1)的二年生霍山石斛水提物组、浓度分别为(2、4、6、8、10 mg·mL-1)的三年生霍山石斛水提物组。

2.3.2 细胞复苏及培养

2.3.2.1 细胞复苏

快速从液氮罐取出细胞冻存管，37℃水浴快速解冻，加到10 mL无菌离心管中并加入6 mL含10%血清的DMEM培养液，轻吹混匀，1200 r·min-1离心5 min，弃上清液，加入含10%血清的DMEM培养液重悬细胞，在CO2培养箱(37℃，5% CO2)中进行培养。

2.3.2.2 细胞传代培养

待细胞生长至80%左右，吸除旧培养基，用PBS缓冲液清洗2次，加适量胰蛋白酶消化液消化2 min，加入含10%血清的培养基终止消化，将细胞吹打分散，1000 r·min-1离心5 min，弃上清，加入适量含10%血清的培养基，置37℃，5% CO2孵育箱中培养。

2.3.3 CCK-8法检测细胞活性

取对数生长期的HeLa细胞，用胰蛋白酶消化，调整细胞浓度并接种于96孔细胞培养板中(5×104/mL，每孔100 μL)，在CO2孵育箱(37℃，5% CO2)中进行培养。分别加入不同浓度的不同生长年限霍山石斛水提物，每个浓度设5个复孔，培养24 h后弃上清，每孔加入10 μL CCK-8溶液继续培养3 h后于450 nm处测定OD值，计算细胞增殖抑制率。

细胞增殖抑制率(%)=(A0-A1)/A0

注：A0为阴性对照组，A1为给药组OD值。

2.4 数据处理

数据采用GraphPad Prism 6.0软件进行单因素方差分析，数据以¯x±s表示，应用SPSS 22.0软件进行多成分配对检验等处理，P<0.05表示差异具有统计学意义，P<0.01表示差异有重要统计学意义。

3 结 果

3.1 不同生长年限霍山石斛主要成分含量

课题组前期测定不同生长年限霍山石斛多糖、总黄酮、总生物碱和石斛酚含量如表1所示[34]。不同生长年数霍山石斛的4种化学成分含量差异较大，其中霍山石斛黄酮和生物碱含量随年份增加而增加，3年生含量最高，1年生含量最少。而2年生多糖和石斛酚含量最高，3年生含量最低。

表1 不同生长年数霍山石斛4种成分平均含量

3.2 不同生长年限霍山石斛对HeLa细胞增殖的影响

与空白组相比，不同生长年限霍山石斛水提物作用于HeLa细胞24 h后，质量浓度在2-10 mg/mL范围内均可抑制HeLa细胞活力，且随着浓度的升高，细胞增殖抑制作用增强。同一浓度下，3年生霍山石斛水提物对HeLa细胞增殖抑制率均高于2年生霍山石斛，1年生霍山石斛对HeLa细胞增殖抑制率最低，如图1。

图1 不同生长年限霍山石斛水提物对HeLa细胞增殖的抑制作用Fig. 1 Proliferation of HeLa cells inhibited by water extracts of D. huoshanense of different growth years

3.3 不同生长年限霍山石斛抗炎作用比较

与模型组相比较，不同生长年限霍山石斛低高剂量组均能降低二甲苯所致小鼠的耳肿胀度(P< 0.01)。1年生霍山石斛低高剂量组、2年生低剂量组和3年生低剂量组耳肿胀度抑制均高于地塞米松组，差异具有统计学意义(P< 0.05)。2年生高剂量组和3年生高剂量组耳肿胀度与地塞米松组没有显著性差异(P> 0.05)，表明2年生和3年生高剂量组抗炎效果与阳性组相近。各给药组中，2年生高剂量组小鼠耳肿胀抑制率最高，达到58.80%，3年生高剂量组耳肿胀抑制率也较高，达到56.93%。结果见表2。

表2 不同生长年限霍山石斛对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响

3.4 不同生长年限霍山石斛抗肿瘤药性配对t检验

为判断不同生长年限石斛治疗肿瘤是否具有显著差异，分别提取了1年、2年和3年生的霍山石斛药性，在不同浓度下分别利用SPSS软件对其进行配对样本t检验，表3给出检验结果，结果显示1年期和3年期，以及2年期和3年期配对检验的P值都小于0.05，并且随着浓度增大1年生和2年生之间也呈现显著性差异，这充分说明选择不同年份的石斛治疗肿瘤具有重要意义。

表3 不同生长年限霍山石斛抗肿瘤药性配对t检验

4 讨 论

本试验研究了不同生长年限霍山石斛活性成分多糖、黄酮、生物碱和石斛酚的含量差异以及不同生长年限霍山石斛抗炎、抗肿瘤作用差异。研究发现，不同生长年限霍山石斛4种主要成分差异显著，各成分含量与生长年限并不完全成线性增长关系。黄酮和生物碱含量随着生长年限增加而增加，3年生最高，1年生最低，而2年生多糖和石斛酚含量最高，3年生含量最低。本试验所得2年生霍山石斛多糖含量最高，铁皮石斛[35]、叠鞘石斛[36]的多糖含量也是2年生最高，但金钗石斛[37]的多糖含量却是1年生最高。由此可见，不同品种石斛多糖含量与生长年限的变化规律并不一致，多糖的合成受多种因素的影响，霍山石斛不同生长发育阶段多糖含量产生差异有关的因素仍有待进一步研究。

不同生长年限霍山石斛对二甲苯致小鼠耳肿胀模型的抗炎作用的试验结果表明，不同生长年限的霍山石斛均具有较好的抗炎作用，2年生霍山石斛的抗炎作用最佳。4种成分含量测定结果显示2年生霍山石斛多糖和石斛酚含量明显高于3年生和1年生，有研究报道，霍山石斛多糖和石斛酚具有抗炎活性[38-41]，由此推测不同生长年限霍山石斛抗炎药效的不同主要与多糖和石斛酚有关。

不同生长年限霍山石斛对宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制作用的试验结果显示，3年生霍山石斛对HeLa细胞增殖的抑制作用最强。4种成分含量测定中，3年生霍山石斛黄酮和生物碱含量明显高于其他年限。霍山石斛生物碱类具备养胃清热[42]、降低血压和心率[43]和抗氧化活性[44]。黄酮类物质具有抑制肺癌细胞[45]、卵巢癌细胞[46]迁移和侵袭、保肝作用[47]。因此，可推测不同生长年限霍山石斛抗肿瘤作用差异主要与黄酮类物质有关，是否与生物碱有关有待进一步研究。

综上所述，本试验通过研究不同生长年限霍山石斛4种活性成分多糖、黄酮、生物碱和石斛酚的含量差异以及不同生长年限霍山石斛抗炎、抗肿瘤作用差异。结果显示，2年生霍山石斛的抗炎作用最佳，3年生霍山石斛对HeLa细胞增殖的抑制作用最强，霍山石斛抗炎药效可能与多糖和石斛酚有关，霍山石斛抗肿瘤作用可能与黄酮有关。本研究为霍山石斛的合理选择采收期和药效物质基础研究提供了新的参考依据。