基于微卫星多重PCR技术的兰州鲇亲子鉴定

2021-06-02李兰兰邢露梅俞兆曦赛清云刘彦斌田永华哲连总强

水生生物学报 2021年3期

李兰兰邢露梅俞兆曦, 肖伟, 赛清云, 刘彦斌, 田永华,王燕,刘哲连总强,*

(1. 甘肃农业大学动物科学技术学院, 兰州 730070; 2. 宁夏回族自治区水产研究所(有限公司), 银川 750001;3. 宁夏渔业工程技术研究中心, 银川 750001; 4. 宁夏渔业科技院士工作站, 银川 750001)

兰州鲇(Silurus lanzhouensis)又名黄河鲶, 隶属于鲇形目(Siluriformes)鲇科(Siluridea)鲇属(Silurus)[1], 为我国黄河中上游特有的大型土著鱼类, 2004年已被《中国物种红色名录》列为濒危物种[2]。2007年农业部批准建立宁夏卫宁段兰州鲇国家级水产种质资源保护区, 2014年兰州鲇被评为黄河生物名片[3]。近些年宁夏回族自治区水产研究所已先后攻克了兰州鲇人工繁育等技术难题, 成为目前国内最大的保种救护繁育基地, 每年向黄河增殖放流大规格苗种50万尾以上, 在一定程度上恢复了这一濒危鱼类种质资源, 但同时也面临着因多年累代繁育引起的种质退化问题。针对近些年产业结构调整、市场需求度较大和养殖户积极性较高的实际需求, 课题组也在加快兰州鲇良种新品种的选育工作[4,5], 但以往家系选育中采用不同家系不同池塘或不同网箱培育选择, 面临环境差异、基础设施投入及管理力度加大等问题; 采用电子标记进行家系个体标记存在幼体无法标记、标记易脱落、标记昂贵和标记费时费力等困难。因此, 建立有效的亲子鉴定及系谱管理技术是开展兰州鲇种质资源救护保存和良种新品种选育中避免近交衰退的急需关键技术手段。

随着分子标记技术发展, 微卫星(Microsatellites)以其广泛分布于基因组中, 遵循孟德尔共显性遗传定律, 多态性高且易于PCR扩增等优点[6]被广泛应用于水产生物家系系谱关系管理等方面。多重PCR(Multiplex PCR)首次由Chamberlian等[7]提出,因其可大大降低因大量样品重复处理带来的人为误差, 且较分批次单个PCR更加高效、便捷和经济,目前被广泛应用于人类医学和动植物研究中, 尤其是为大样本量水生生物亲缘关系分析[8]、群体遗传多样性分析[9]、遗传分离模式分析[10]和种质鉴定[11]等研究提供了有力的技术手段。基于此, 本研究开展兰州鲇微卫星多重PCR体系构建并建立可靠的亲子鉴定技术, 以期为今后开展兰州鲇家系良种选育、种质系谱管理及资源救护繁育等方面工作提供有力技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2019年6—8月在宁夏回族自治区水产研究所国家级黄河鲶原种场进行, 随机选取2018年建立的3个家系, 编号为7-1、8-8和8-11, 每个家系随机选取30尾子代, 候选亲本样本由6尾真正亲本和14尾(雌、雄各7尾)非亲本组成, 另从7-1中随机选取18尾, 8-8和8-11中随机各选取16尾共50尾子代用于双盲实验。此外, 随机选取16尾兰州鲇养殖群体用于构建兰州鲇微卫星多重PCR体系。所有样本均采集尾鳍组织, 用75%乙醇固定后置于–80℃冰箱中保存备用。

1.2 试验方法

基因组DNA提取兰州鲇样本基因组DNA的提取参考杨忠礼等[12]改进的酚-氯仿法结合DNA产物纯化试剂盒法, 超微量核酸分析仪检测浓度及OD值, 3%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。将合格的DNA用ddH2O稀释至50 ng/μL, −20℃保存备用。

微卫星多重PCR引物筛选及优化根据微卫星位点的多态性、序列重复单位及扩增效果等,从已开发的兰州鲇微卫星[13,14]中筛选出18个位点。将每对引物信息通过Multiplex Manager1.0[15]软件模拟检测, 避免产生错配、引物二聚体和发卡结构等, 先进行2个位点之间组合, 然后在扩增效果较好的2重PCR体系中添加另一对引物筛选3重PCR体系, 以此类推。以16个兰州鲇个体DNA为模板构建多重PCR体系, 通过引物浓度、退火温度和延伸时间等因素优化筛选最佳扩增条件, 3%琼脂糖凝胶电泳检测多重PCR扩增效果。

PCR反应体系PCR反应总体积20 μL, 包括DNA 1 μL(约50 ng), Premix 2×Taq(诺维赞)10 μL,正反向引物各0.5 μL(10 pmol/μL, 武汉天一辉生物科技有限公司合成), 加ddH2O至总体积20 μL。PCR反应程序: 94℃预变性3min, 94℃变性1min,50—60℃退火45s, 72℃延伸1min, 34个循环, 72℃延伸10min, 12℃保存。扩增产物经3%琼脂糖凝胶电泳检测后送武汉天一辉远生物科技有限公司进行STR测序分析(毛细管电泳检测ABI3730XL全自动DNA测序仪), 最终将优化好的微卫星多重PCR组合用于兰州鲇3个家系的亲子鉴定。

1.3 数据统计及分析

采用GeneMarker软件[16]读取等位基因值; 采用χ2检验家系中各位点分离模式是否满足孟德尔遗传定律(1∶1、1∶2∶1 和 1∶1∶1∶1), 显著性水平设置为P＞0.01; 用Cervus v.3.0软件[17]进行亲子鉴定分析,具体参数包括等位基因数(Number of allele,Na)、有效等位基因数(Number of effective allele,Ne)、观测杂合度(Observed heterozygosity,Ho)、期望杂合度(Expected heterozygosity,He)、香农信息指数(Shannon Wiener index,I)、无效等位基因频率[Null allele frequency,F(Null)]及多态信息含量(Polymorphism information content,PIC), 计算各位点的平均排除概率(Exclusion probability,EP)、累积排除概率(Combined exclusion probability,CEP)、模拟鉴定率及实际鉴定率(置信区间为95%); 利用软件GenAlex 6[18]计算110尾个体和50尾双盲子代遗传距离, 采用MEGA 7.0[19]软件构建系统进化树。

2 结果

2.1 微卫星多重PCR建立

本研究从已筛选出多态性高、扩增效率较好的18对微卫星标记中, 通过不同组合扩增, 最终选取14个微卫星位点科学设计优化确定了2组三重PCR和2组四重PCR, 所建立的各组多重PCR退火温度、引物浓度以及片段大小见表 1。图 1为部分兰州鲇个体四组多重PCR片段测序扫描图, 由图 1可见4组多重PCR体系各位点扩增效率均较好, 易于识别各位点等位基因大小。

2.2 群体遗传多样性分析

4组微卫星多重PCR在90尾子代和20尾亲本中遗传参数如表 2所示。等位基因数(Na)为4—19, 平均等位基因数为8.214; 有效等位基因数(Ne)为2.117—7.704, 平均有效等位基因数为3.652; 观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)分别为0.527—0.964和0.528—0.870; 平均观测杂合度为0.750, 平均期望杂合度为0.667; 香农信息指数(I)为0.958—2.268,平均香农信息指数为1.393; 14个位点中有6个位点(SLsis118、SLsis165、SLsis173、SLsis83、SLsis14和SLsis76)的无效等位基因频率(F(Null))大于10%;多态信息含量(PIC)为0.500—0.858, 平均多态信息含量为0.624, 各位点均表现为高度多态性(PIC＞0.5)。

2.3 微卫星在子代分离模式

由表 3可知, 在获得的42个基因型分离比(14位点×3家系)中, 有2个为同一杂合状态基因型(亲本等位基因不同且为纯合), 对剩余40个分离模式进一步分析发现, 排除无效等位基因和无法分析的情况,仍有3个基因型分离比偏离孟德尔分离定律(P＜0.01), 在3个家系共168个等位基因中(14个位点×6个亲本× 2), 无效等位基因频率为2.4%。

表 1 四组兰州鲇微卫星多重PCR筛选结果Tab. 1 The results of 4 multiplex PCR screening in S. lanzhouensis

图 1 部分兰州鲇个体4组多重PCR的基因扫描图Fig. 1 Part of gene scan results of four sets multiplex PCR in S. lanzhouensis

表 2 14个微卫星位点在兰州鲇3个家系中的遗传参数Tab. 2 Genetic parameters in 3 families of S. lanzhouensis by using 14 microsatellite makers

表 3 多重PCR在兰州鲇3个家系中的微卫星基因型分离比Tab. 3 Segregation analysis of microsatellite alleles in 3 families of S. lanzhouensis

续表 3

2.4 亲权分析

利用4组微卫星多重PCR对兰州鲇3个家系进行亲子鉴定排除概率分析, 由表 4可知, 当双亲基因型均未知时, 单个微卫星位点排除概率(E-1P)为0.097—0.591, 累积排除概率(CE-1P)为0.99753092;当单亲基因型已知时, 单个微卫星位点排除概率(E-2P)为0.172—0.745, 累积排除概率(CE-2P)为0.99983971; 当双亲基因型均已知时, 单个微卫星位点排除概率(E-PP)为0.262—0.904, 累积排除概率(CE-PP)为0.99999964。由图 2可知, 根据单个多重PCR组合的鉴定率由高到低依次添加组合, 4组多重PCR模拟累积鉴定率为100%, 实际累积鉴定率为83%。

2.5 聚类分析

进一步利用110尾已知系谱亲本及子代个体遗传信息进行聚类分析验证, 结果表明在遗传距离大于0.4时, 3个家系能够分别聚类, 鉴定准确率为95.46%(图 3)。50尾双盲子代聚类分析验证结果表明, 除2号、15号和48号个体未能确定其亲本外, 其余47尾个体能够确定其亲本, 聚类分析鉴定准确率为94.00%(图 4)。

3 讨论

3.1 微卫星多重PCR建立

据相关文献报道, 影响多重PCR扩增效率的主要因素包括反应体系(引物、Mg2+、dNTPs、缓冲液、DNA模板和DNA聚合酶等)和反应条件(退火温度、延伸时间和循环数等)[20—22]。本研究在构建兰州鲇微卫星多重PCR体系时发现, 引物组合及其浓度、退火温度和延伸时间是影响多重PCR体系构建成败的主要因素。在引物组合设计方面, 要确保同一位点上下游引物及不同引物间不能形成错配、二聚体及发卡结构。在引物浓度比例设计方面, 需进行不同引物浓度优化筛选, 以避免出现非特异性产物或扩增效率高的引物抑制其他引物导致扩增失败。在延伸时间方面, 以优化引物组合、引物浓度配比等因素为前提, 尚需进行延伸时间条件筛选, 避免因扩增时间太久导致酶和dNTPs等物质缺乏造成无法同时扩增多个位点[23]。在退火温度方面, Kong等[24]认为多重PCR体系中各引物间退火温度相差不宜超过5℃。本研究先对每对引物进行单位点扩增以确定每对引物退火温度, 再将退火温度相差不超过5℃的引物组合进行温度梯度PCR筛选, 最终确定了4组多重PCR最佳退火温度。

表 4 兰州鲇亲子鉴定的排除概率和累积排除概率Tab. 4 Exclusion probability and cumulative exclusion probability for parentage assignment in S. lanzhouensis

图 2 已知兰州鲇双亲基因型时实际累积鉴定率和模拟累积鉴定率Fig. 2 The real cumulative assignment rate and simulation cumulative assignment rate with known parental genotypes in S.lanzhouensis

3.2 群体遗传多样性分析

生物群体遗传多样性常用于评测生物种质资源状况[25], 等位基因数(Na)、杂合度(Ho/He)及多态信息含量(PIC)则为群体遗传多样性的重要评估指标, 多态性越高, 遗传多样性水平越高, 则家系亲子鉴定的成功率和准确率就越高[26]。根据Bostein等[27]所提出的多态信息含量指标范围:PIC≥0.5时为高度多态, 0.25≤PIC＜0.5为中度多态,PIC＜0.25为低度多态。本研究中14个微卫星位点的平均期望杂合度(He)为0.667, 平均观测杂合度(Ho)为0.750,PIC平均值为0.624, 表现为高度多态。这一结果与吴旭东等[28]利用兰州鲇19对微卫星引物对野生和人工繁育2个群体遗传多样性分析结果(He0.773,Ho0.887,PIC0.705)相近。以上数据表明, 本研究选用的微卫星标记具有较高的遗传多样性, 可用于后续家系亲权分析。

3.3 微卫星在子代分离模式

微卫星位点分型时常存在无效等位基因的情况, 通过子代基因分离比可反应研究中无效等位基因的存在情况。通过本研究14个位点在子代中的分离模式发现, 排除无效等位基因和无法分析的情况, 仍有3个基因型分离比偏离孟德尔分离定律。同样, 陈辰等[29]和聂鸿涛等[11]分别应用10对和12对微卫星位点对毛蚶(Scapharca kagoshimensis)和皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)进行子代基因分离模式研究, 在考虑无效等位基因存在的情况下, 发现分别有2个和8个位点基因型分离比偏离孟德尔分离定律。由此结合相关研究推测, 在基因转换、减数分裂过程中, 因染色体非随机分离或同致死主效基因连锁等原因, 可造成此类现象发生[30]。

图 3 110个体聚类分析图Fig. 3 The cluster analysis diagram in 110 S. lanzhouensis

3.4 亲权分析

近些年来, 亲权关系分析被广泛应用于种质资源保护、系谱信息完善、遗传参数分析及良种新品种选育等方面[31]。在亲子鉴定中, 基于排除概率的遗传排除法是进行系谱关系鉴定最为简单有效的方法[32]。王敏[33]研究表明, 若CEP≥99.73% 时,则可认定存在亲子关系; 若95%＜CEP≤99%时, 则有可能存在亲子关系; 若CEP＜80%时, 则不能确定存在亲子关系。陈亮等[34]利用长鳍吻鮈(Rhinogo-bio ventralis)15个微卫星位点构建了5组三重PCR体系, 仅使用其中3个组合, 在单亲基因型已知情况下,其累积排除率可达到99.99%以上。本研究利用兰州鲇14个微卫星位点构建了2组四重PCR和2组三重PCR体系, 以排除法分析兰州鲇家系间亲子关系,无论亲本基因型是否已知, 其累积排除概率均大于99.73%, 因此4组微卫星多重PCR可用于鉴定兰州鲇家系间亲权关系。

图 4 50个双盲个体聚类分析结果Fig. 4 Cluster analysis of 50 double-blind individuals

本研究中14个微卫星位点模拟鉴定率可达100%,而实际鉴定率为83%, 这与有关翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)[35]和黄喉拟水龟(Mauremys mutica)[21]的研究结果相似。据相关研究报道, 家系亲本选择、无效等位基因存在及基因型统计误差等因素均可造成实际鉴定率小于模拟鉴定率的现象。本研究选用家系亲本来自多个池塘经群体选育后进一步选择优秀个体进行同池塘混合培育的优良个体, 选育中仍存在因三代繁育、人工选择及人为误差等造成其亲缘关系较近的可能, Jones等[32]认为亲本亲缘关系过近会降低亲子鉴定的准确性。其次, 本研究中有6个位点的无效等位基因频率大于10%, 无效等位基因会导致样本杂合子缺失和低质量DNA, 从而影响鉴定准确度[36]。此外, 本研究中荧光标记PCR产物经DNA测序仪ABI 3730xl进行荧光电泳检测, 其扩增效果差异、DNA模板质量以及检测软件读取等因素亦可影响鉴定结果的准确度。

3.5 聚类分析

基于可靠分子标记的聚类分析常用于物种鉴定分类、起源进化等方面[37,38]。为进一步验证亲子鉴定准确性, 本研究通过110尾已知系谱亲本及子代个体和50尾双盲子代聚类分析发现, 鉴定准确率可分别达到95.46%和94.00%。50尾双盲个体聚类分析中出现3尾样本聚类错误, 可能因某些位点扩增效率过低和目标片段差异过小引起基因型统计误差, 及在PCR扩增中引物滑动等原因造成[39]。基于遗传排除法和聚类分析的结果表明, 本研究建立的4组多重PCR体系具有较好的稳定性和可靠性。