玉米灵芝菌粮营养成分及加工特性变化研究

雷彤彤, 王丽花, 吴元元, 陈妍菲, 唐选明*

1.中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193；2.山东惠民齐发果蔬有限责任公司，山东 滨州 256600；3.汉中三道中瑞生态农业科技有限公司，陕西 汉中 723000

随着生活水平的提高，人们更加注重饮食健康，粗粮食品开始受到大众青睐。玉米是世界三大粮食作物之一，含有多种人体必需氨基酸、维生素、胶蛋白、单糖、谷胱甘肽和粗纤维等，是公认的健康食品[1]。但是玉米中有限制性氨基酸——赖氨酸和色氨酸，缺乏硫胺素，营养结构不均衡；玉米淀粉被蛋白质包裹，吸水膨胀性差，球蛋白和谷蛋白疏水能力强，导致玉米粉在食品加工过程中难以形成网状结构，面团黏弹性差，柔韧性差，食用口感粗糙[2]，极大地限制了玉米粉的加工应用。

利用微生物固态发酵技术可以在很大程度上改良玉米在营养和加工方面的缺陷。研究表明，微生物在固态发酵过程中发生多种生物化学变化，可以改变谷物中营养组分和抗营养组分的比例，提高产品的营养价值和感官性状等[3]。目前，国内外许多专家学者分别从营养成分、大分子物质结构和加工特性等方面研究了微生物固态发酵对谷物的改良作用。如利用姬松茸固态发酵小麦、大米等7种谷物，随着发酵时间的延长，谷物的营养价值显著提高[4]；利用米曲霉(Aspergillusoryzae)固态发酵玉米粉，发酵过程中淀粉颗粒逐渐破碎，淀粉的理化性质发生了强烈的变化[5]；利用乳酸菌改性玉米粉，玉米粉的凝沉性下降，膨胀度、溶解度及透光性提高，加工特性显著改善[6]。上述研究表明，微生物固态发酵谷物可以提高其营养价值，使淀粉颗粒破碎，结构发生改变，从而改善谷物的加工特性[4-6]。但是目前对于谷物改性的研究大多只针对某一方面的变化，且常用的发酵菌株有细菌(乳酸菌和枯草芽孢杆菌)、真菌(酵母菌和霉菌)以及多菌株混合发酵等，利用食用菌进行发酵，并对谷物营养成分、物质结构以及加工特性进行全面评价的研究较少。

灵芝是一种具有两千多年历史的高等药用真菌，含有多糖、三萜、核苷和甾醇类等多种功能活性成分[7]，研究发现灵芝具有增强免疫力、保肝护肝、改善睡眠和降血糖等药理功能[8]，近年来，灵芝固态发酵技术备受研究者的关注。本研究以玉米原粮为培养基质，选取日本赤灵芝(GanodermalucidumKarst.)为发酵菌种，进行固态发酵获得玉米灵芝菌粮(Ganodermalucidumfermented corn，GFC)，并系统分析玉米灵芝菌粮与玉米原粮在营养和生物活性成分、氨基酸评分(amino acid score，AAS)、大分子物质结构、加工特性等方面的变化，以期为食用菌发酵改良谷物特性以及新型食用菌功能配料的开发和应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

日本赤灵芝(GanodermalucidumKarst.)斜面菌种购于北京吉蕈园科技有限公司；郑单958黄玉米购于北京金土地农业技术研究所。

马铃薯葡萄糖肉汤培养基购于北京奥博星生物技术有限责任公司；淀粉试剂盒、直/支链淀粉试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；其他主要试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器与设备

BLC-150111恒温恒湿箱(北京陆希科技有限公司)；SKY-200B摇床(上海苏坤实业有限公司)；RS-FS1401研磨机(荣事达公司)；DW-86L338(J)医用低温保存箱(青岛海尔特种电器有限公司)；Spark多功能微孔板检测仪(瑞士Tecan公司)；DK-8D三孔电热恒温水槽(上海一恒科学仪器有限公司)；MCR-301流变仪(奥地利Anton Paar有限公司)。

1.3 方法

1.3.1菌粮制备在无菌环境中，将4 ℃保存的日本赤灵芝斜面菌种接种到马铃薯葡萄糖肉汤液体培养基中，25 ℃、140 r·min-1摇床培养3～4 d。挑选后的玉米于沸水浸泡2 h，按玉米湿重质量加入3%葡萄糖、0.1%磷酸二氢钾和0.2%七水硫酸镁，灭菌2 h，作为培养基质。在无菌环境中，取5%～10%的活化菌种接种到固体培养基中，并搅拌均匀，25 ℃培养至菌丝长满，烘干，磨粉，得到玉米灵芝菌粮。

1.3.2菌粮营养成分测定为探究灵芝固态发酵对玉米粉营养物质含量的影响以及对营养结构的改良作用，对发酵前后菌粮基础营养物质、功能活性成分及氨基酸评分进行测定。

总可溶性蛋白质含量根据GB5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法测定[9]；粗脂肪含量根据GB5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》中索氏抽提法测定[10]；碳水化合物根据ASTM E1758—2001(2007)高效液相色谱法测定[11]；灰分含量根据GB5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中的测灰分定》中高温马弗炉法测定[12]；灵芝三萜含量参考李保明等[13]，采用香草醛-高氯酸比色法测定；灵芝酸含量参考黄羽[14]，采用紫外可见光分光光度法测定；维生素含量根据食品安全国家标准中高效液相色谱法测定[15-19]；氨基酸含量根据GB5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》中氨基酸分析仪测定[20]；AAS根据式(1)计算[21]。

AAS=

(1)

1.3.3菌粮大分子物质结构测定为探究灵芝固态发酵对玉米粉大分子物质结构的影响，对发酵前后菌粮的淀粉及膳食纤维结构进行测定。

利用试剂盒测定淀粉、直/支链淀粉含量；粗纤维含量根据GB/T-5515—2008《食品安全国家标准 食品中粗纤维的测定》中介质过滤法测定[22]；膳食纤维含量根据GB5009.88—2014《食品安全国家标准 食品中膳食纤维的测定》中酶重量法测定[23]。

1.3.4菌粮加工特性测定为探究灵芝固态发酵对玉米粉加工性的影响，对发酵前后菌粮的粘度等加工特性进行测定。

粘度的测定参考赵志浩等[24]的方法，取20 g干燥至恒重的样品加入80 mL 80 ℃热水配成淀粉糊，利用流变仪进行测定。水溶性指数(water solubility index, WSI)、吸水性指数(water absorption index, WAI)和溶胀力(swelling power, SP)的测定参考Li等[25]和Anderson等[26]的方法。取2.5 g样品加入30 mL去离子水，275 r·min-1振摇30 min，5 300 r·min-1离心15 min。上清液倒入预先干燥至恒重的称量瓶中，105 ℃蒸发至恒重。WSI、WAI 和SP的计算公式如式(2)(3)(4)所示。

(3)

(4)

1.4 数据处理

本研究所有的测定至少进行3次重复，结果以平均值表示。通过SPSS 17软件对所有数据进行差异显著性分析，P<0.05表示差异显著，用Origin 9.0软件进行实验结果分析图的绘制。

2 结果与分析

2.1 菌粮营养成分分析

2.1.1主要营养成分灵芝属于微生物，具有微生物发酵特性，在生长过程中会分解利用培养基质中的营养成分促进自身生长，同时又能通过其生物合成作用生成某些营养物质[27-28]。为探究发酵前后基础营养成分的变化规律，对菌粮蛋白质、脂肪、碳水化合物和灰分含量进行分析，结果如图1所示。发酵后菌粮中蛋白质含量提高了28.00%，脂肪含量降低了52.56%，碳水化合物含量提高了7.48%。蛋白质含量升高的原因可能是灵芝具有较强的蛋白质合成能力；发酵过程中产生的酸及酶类物质使脂肪等大分子物质被分解，含量降低[3]；灵芝中含有的纤维素和灵芝多糖等物质使碳水化合物含量升高。

注：*表示同一指标在玉米和灵芝菌粮中差异显著(P<0.05)。

2.1.2功能活性成分灵芝菌丝体吸收发酵基质中的营养物质，进行生理代谢，可产生多种活性成分[29]。其中，灵芝三萜是灵芝中特有的一类三萜类化合物，具有抗肿瘤、保护肝脏、抗HIV-1及HIV-1蛋白酶活性、抗组织胺释放、抗衰老、抗微生物、降血脂、降血糖等生物学功能[30]。通过灵芝子实体获取灵芝三萜的过程时间较长且稳定性差，目前常用液态深层发酵技术获取，而灵芝酸为灵芝中一类主要的三萜类物质，玉米中不含此类物质。为了探究发酵作用对玉米功能活性的影响，测定了灵芝菌粮中灵芝三萜和灵芝酸含量，结果如图2所示。发酵后菌粮中灵芝三萜的含量为11.47%，灵芝酸含量为3.15%，均显著高于灵芝子实体(P<0.05)，分别为灵芝子实体的1.68、2.07倍。含量的差异可能与培养基质的种类、培养方式以及取样时间有很大关系，此结果对于研究以谷物为培养基固态发酵获取灵芝三萜以及进行菌粮功能性产品的开发具有重要意义。

注：*表示同一指标在灵芝菌粮和灵芝子实体中差异显著(P<0.05)。

2.1.3维生素含量鲜食玉米中维生素含量高，但是干制玉米粉维生素含量损失大，尤其是水溶性的B族维生素，导致玉米粉营养价值降低，营养结构不均衡。发酵可以改变培养基中维生素的含量，为探究灵芝固态发酵玉米对其中维生素含量的影响，测定了菌粮中各种维生素含量，结果如表1所示。对照组中，缺乏硫胺素，核黄素含量也很低，经过发酵以后，玉米灵芝菌粮中维生素C、核黄素以及烟酸的含量均显著提高(P<0.05)，分别提高了56.19%、73.91%、20.27%。玉米中缺少的硫胺素在菌粮中的含量为0.20 mg·100 g-1。表明利用灵芝固态发酵玉米，可以增加其中维生素的种类及含量。

表1 玉米及菌粮中维生素含量

2.1.4菌粮AAS氨基酸的生物利用度不仅取决于蛋白质和氨基酸含量，蛋白质的质量也起着重要的作用。蛋白质中含有的氨基酸的种类、人体必需氨基酸的组成和比例、限制氨基酸的最低含量等是衡量食物中蛋白质营养价值的一个重要指标[31]。AAS值越接近100，食物蛋白与人体蛋白越接近，蛋白质的营养价值也就越高。因此，本研究测定了玉米和发酵后菌粮的氨基酸含量与AAS，结果如表2所示。AAS与FAO/WHO推荐值比较，发酵前菌粮中赖氨酸评分只有29.36，为第一限制性氨基酸，缬氨酸、蛋氨酸+半胱氨酸的含量也很低，均低于FAO/WHO推荐值[32]，蛋白质的营养价值较低；发酵后，多数必需氨基酸的评分均有所提高，菌粮蛋白质中赖氨酸的评分提高为67.86，所有氨基酸评分均高于FAO/WHO推荐值，更接近100，蛋白质营养价值提高。由此可见，灵芝固态发酵，可以弥补玉米中氨基酸含量不足的缺陷，使菌粮具有更高的营养价值。

表2 玉米及菌粮AAS比较

2.2 菌粮大分子物质结构分析

2.2.1淀粉、直链淀粉、支链淀粉含量淀粉的结构以及支链、直链淀粉的比例是影响其加工特性的主要原因，因此研究菌粮淀粉结构变化对其加工特性变化的研究具有重要意义。此外，研究表明，发酵作用会瓦解淀粉颗粒，使淀粉相对分子质量减小，直链淀粉含量增多;同时,部分支链淀粉的α-1,6-糖苷键在微生物分泌的支链淀粉酶的作用下断裂，侧链脱支，支链淀粉含量降低[33]。为探究灵芝固态发酵玉米过程中淀粉结构变化规律，测定了玉米和菌粮中淀粉含量的变化，结果如图3所示。菌粮中淀粉、支链淀粉含量分别降低了11.17%、34.70%，直链淀粉含量提高了26.66%。表明灵芝固态发酵玉米会使淀粉颗粒结构发生改变，从而使淀粉的加工特性发生改变。

注：*表示同一指标在玉米和灵芝菌粮中差异显著(P<0.05)。

2.2.2菌粮粉纤维含量粗纤维和不溶性膳食纤维(insoluble dietary fiber，IDF)不易被人体消化吸收，降低了肠道对小分子营养物质的利用率；而可溶性膳食纤维(soluble dietary fiber，SDF)具有多种功能，是一些乳酸菌和双歧杆菌的生长基质，对肠道健康有益，能够控制血糖指数，降低血浆胆固醇[34]。因此，本研究测定了玉米和菌粮中纤维含量变化，结果如图4所示，粗纤维以及IDF含量分别减少了21.07%和21.47%，SDF含量提高13.57%。可见，灵芝固态发酵提高了玉米中营养物质的吸收利用率和生理活性，同时也改善了玉米粉的适口性。此外，膳食纤维的生理功能与其SDF和IDF的比例有关，高品质的膳食纤维要求SDF和IDF的比例为1∶3[35]。未发酵的玉米中IDF的含量过高，膳食纤维品质较低；经过发酵以后，SDF和IDF的比例更接近1∶3，菌粮中膳食纤维的品质提高，具有更好的生物活性。

图4 玉米及菌粮中膳食纤维含量

2.3 菌粮加工特性分析

2.3.1表观粘度糊化淀粉的表观粘度在很大程度上取决于淀粉链的链长和分支程度[36]，粘度大小会影响菌粮粉作为食品配料的加工适应性。图3表明发酵使菌粮淀粉结构发生显著变化(P<0.05)，为探究此变化对菌粮加工适应性的影响，本研究测定了玉米和菌粮表观粘度变化，结果如图5所示。剪切速率从1 s-1升高到100 s-1，灵芝菌粮的粘度最高达到0.10 Pa·s，在任何剪切速率下均低于未发酵玉米，表明发酵作用导致的淀粉结构变化进一步影响了玉米粉的加工性，粘度较低的菌粮粉在水中更易分散，具有更好的冲调特性。

图5 不同剪切速率玉米及菌粮粘度变化

2.3.2WSI、WAI和SPWSI、WAI和SP与菌粮中大分子物质的大小、形态等密切相关，反映了淀粉的持水性和大分子降解程度[37]。2.2中的结果表明灵芝固态发酵使玉米中大分子物质结构发生显著变化，因此，本研究测定了玉米和菌粮的WSI、WAI和SP，结果如表3所示。经过发酵后得到的菌粮水溶性显著提高(P<0.05)，吸水性和溶胀力显著降低(P<0.05)。水的吸收和结合是蛋白质的功能特性之一，同时，直链淀粉和支链淀粉以不同的方式控制淀粉的溶胀，但是，已知支链淀粉会促进淀粉颗粒的溶胀，然后形成糊状，而直链淀粉和脂质则抑制溶胀[38]。因此，吸水性的变化可能与菌粮中较大的淀粉碎片和大分子蛋白质被分解有关，水溶性提高表明部分淀粉被酶解为中小分子中间物质，即糊精，而溶胀力的降低可能与直链淀粉含量的增多有关。

表3 玉米及菌粮WSI、WAI和SP值

3 讨论

近几年，以玉米为代表的五谷杂粮由于营养价值高，维生素、膳食纤维等含量丰富，受到人们的青睐。但是粗粮食品仍然存在营养结构不均衡、加工特性差的缺点，造成营养物质吸收利用率低、加工适应性低、产品口感不好等问题，而微生物固态发酵技术可以在很大程度上解决这些问题。

本研究利用灵芝固态发酵玉米获得的玉米灵芝菌粮，与玉米原粮相比，营养物质的含量发生变化，比例更加均衡，同时具有较高的生物活性；大分子物质结构发生改变，提高了机体对其中营养物质的吸收利用率；加工特性发生改变，作为新型食品配料开发功能食品的加工适应性更强。

微生物发酵技术历史悠久，微生物独特的生长特性和发酵作用机制一直是国内外研究热点，近几年，对于微生物发酵改良谷物的研究也有了一定基础。在对营养成分的研究中，Kazanas等[39]通过自然发酵使高粱中赖氨酸和色氨酸含量增加；Hiran等[40]分别利用植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和长双歧杆菌(Bifidobacterium)发酵玉米种子，其中蛋白质、维生素B1以及维生素E的含量均得到显著提高；本研究所得结果也表明灵芝固态发酵后菌粮中赖氨酸、色氨酸以及其他多种必需氨基酸的评分均显著提高，菌粮中除蛋白质和维生素B1含量升高以外，维生素C、维生素B2、维生素B3含量同样有较大的增长，但是维生素E含量减少，与Hiran等[40]的研究结果相反，这可能是由于发酵菌种以及发酵条件不同导致的。在对大分子物质结构的研究中，王平[41]用3种不同乳酸菌发酵玉米淀粉，产物中直链淀粉含量均增加；闵伟红等[42]通过实验室筛选获得高产支链淀粉脱支酶——普鲁兰酶的菌株，发酵玉米粉，直链淀粉含量增加了30.37%，与本研究结果一致，表明发酵可以降解大分子支链淀粉，使其转化为直链淀粉。在加工特性方面，Olanipekun等[43]研究了少孢根霉(Rhizopusoligosporus)发酵大豆粉对其理化性质的影响，随着发酵时间的延长，大豆粉的最大粘度降低，溶胀力和溶解度略有增加；而本研究中菌粮溶胀力比玉米原粮有所下降，溶胀力与样品中直链淀粉含量和直链淀粉、支链淀粉的比例有关，菌粮中直链淀粉比例大于支链淀粉，导致菌粮吸水性和溶胀力降低。

前人研究结果表明，发酵确实可以提高谷物的营养价值，改变其大分子物质结构和加工特性，但是这些研究大多只针对其中某一方面的变化展开，未对三者之间的联系进行系统分析。本研究不仅初步分析了菌粮营养成分、大分子物质结构和加工特性之间的关系及变化机理，且研究所得的玉米灵芝菌粮在生物活性方面具有明显优势，可以将其作为一种新型功能食品配料进行功能食品研发。另外，由于灵芝固态发酵对玉米中大分子物质结构和加工特性的影响，使其在产品制作过程中具有了更好的加工适应性。但是本研究也存在一定的局限性，仅研究了发酵前后菌粮性质的变化，并没有对发酵过程不同时间点做动态生物学研究，在今后的实验中，对于各部分理化性质发生变化的内在机制以及动态变化过程还要进一步更深入地研究，并对菌粮的生物活性进一步挖掘，探究其应用价值，开发具有保健功能的菌粮系列产品。