福建省261株非结核分枝杆菌的菌种鉴定分析

林建 赵永 戴志松 魏淑贞 林淑芳

分枝杆菌属在许多环境相关的研究中均有报道，目前已经有将近200个已确认的种或亚种，从流行病学和疾病相关性的角度可以将分枝杆菌分为3大类：结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex, MTBC)、非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacteria, NTM)和麻风分枝杆菌[1]。NTM广泛分布于环境当中，大多数NTM是条件性致病菌[2-4]。近年来，全球报告的NTM感染率在不断提高[5]，在一些发达国家，比如美国和加拿大，从疑似结核病患者中分离出NTM的比例甚至可超过MTBC[3]，而中国的NTM分离率也已高达22.9%[6]。不同的NTM菌种对抗生素的反应各不相同[7-8]，此外，近期研究发现，NTM可能存在人与人之间的传播[9]，因此，对NTM进行菌种鉴定有重要的意义。笔者通过对从福建省多个结核病耐药监测点和地市级疾病预防控制中心(简称“疾控中心”)结核病实验室收集的NTM菌株进行菌种鉴定和分析，从而为福建省的NTM菌种分布提供参考数据。

资料和方法

一、标本来源

菌株来源于2016年6月至2019年12月，从福建省9个省级结核病耐药监测点(每个地市有1个县作为监测点)和9个地市级疾控中心结核病实验室常规培养的菌株中收集到分枝杆菌菌株3355株，经对硝基苯甲酸(P-Nitrobenzoic acid, PNB)生长试验鉴定后，261株被初步鉴定为NTM菌株，占所有菌株的比例为7.78%(261/3355)。

二、试剂与仪器

含PNB(0.5 mg/ml)的改良罗氏培养基(珠海贝索生物技术有限公司)；Lab-Aid 824S 核酸自动提取仪和提取试剂盒(厦门致善生物科技股份有限公司)；GenoType Mycobacterium CM试剂盒(HAIN Lifescience公司，德国)；MeltPro Myco 试剂盒(厦门致善生物科技股份有限公司)；SLAN-96S型实时荧光定量PCR仪(上海宏石医疗科技有限公司)。

三、实验方法

1. PNB鉴定方法：地市级疾控中心结核病防治科通过国家熟练度测试的专业操作人员对收集的菌株进行NTM初步鉴定。PNB鉴定方法的操作过程以及所使用溶液试剂的配制均按照《结核病实验室诊断技术培训教程》[10]：吸取2～3滴无菌生理盐水于磨菌瓶中，使用接种环刮取2～3周的新鲜菌落于磨菌瓶底部，捻动并用无菌生理盐水将其浊度调至与标准麦氏比浊管一致，使其菌液浓度为1 mg/ml，取0.5 ml菌悬液用无菌生理盐水稀释至10-1mg/ml，用22 SWG接种环蘸取1环并均匀接种至含PNB的改良罗氏培养基表面，置于37 ℃恒温培养，以堪萨斯分枝杆菌为阳性对照菌株和H37Rv为阴性对照菌株。接种后，每周记录菌落的生长状况，缓慢生长分枝杆菌一般需要4周可出现肉眼可见菌落，快速生长分枝杆菌仅需1周左右便可出现肉眼可见菌落。

2. 核酸提取：261株菌株的基因组DNA均采用Lab-Aid 824S核酸自动提取仪自动化提取，提取试剂盒的使用步骤按照说明书进行。

3. GenoType Mycobacterium CM试剂盒菌种鉴定：GenoType Mycobacterium CM试剂盒是目前国内外较常用的商业化分枝杆菌鉴定试剂盒。本试剂盒通过PCR扩增分枝杆菌23S rRNA 上的目的片段，在膜条上进行寡核苷酸探针杂交，通过线性条带显色来判断结果，检测可在5 h内完成。本试剂盒可区分14种临床上常见的分枝杆菌，包括鸟分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、偶然分枝杆菌、戈登分枝杆菌、胞内分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、居间分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、海分枝杆菌/溃疡分枝杆菌、外来分枝杆菌、MTBC、蟾蜍分枝杆菌[11]。

GenoType Mycobacterium CM试剂盒的反应总体系为50 μl，其中包含PNM(引物/核苷酸混合物)35 μl，10×聚合酶缓冲液5 μl，25 mmol MgCl2溶液2 μl，Taq DNA聚合酶0.2 μl，灭菌水3 μl，DNA模板5 μl。使用GT-Blot 48仪进行自动化杂交显色，结果判读按照说明书进行。

4. DNA测序:对GenoType Mycobacterium CM试剂盒鉴定为分枝杆菌属的6株菌株进行测序，以分枝杆菌的ITS序列作为测序的靶标，将每株菌株测序所得到的核酸序列进行NCBI BLASTn比对，在NCBI数据库中找到最匹配的菌种，作为该菌株的菌种鉴定结果。

5. MeltPro Myco试剂盒鉴定混合感染：对GenoType Mycobacterium CM试剂盒鉴定为混合感染的9株菌株，用MeltPro Myco试剂盒进一步鉴定具体菌种。

结 果

一、GenoType Mycobacterium CM 试剂盒菌种鉴定结果

GenoType Mycobacterium CM试剂盒鉴定261株菌株的结果见表1。鉴定出219株试剂盒覆盖范围内的9种分枝杆菌，分别为MTBC 21株、胞内分枝杆菌132株、脓肿分枝杆菌37株、堪萨斯分枝杆菌9株、偶然分枝杆菌8株、鸟分枝杆菌4株、戈登分枝杆菌3株、龟分枝杆菌3株、瘰疬分枝杆菌2株。此外，还鉴定出9株混合感染菌株，即1株菌株同时感染2种或2种以上的分枝杆菌，但是无法鉴定出含有的具体菌种；6株菌株只能鉴定至分枝杆菌属的水平，无法鉴定出具体菌种；18株菌株检测出革兰阳性菌，且不含分枝杆菌；其余9株检测为阴性。

表1 GenoType Mycobacterium CM试剂盒

二、DNA测序结果

经过ITS序列测序，进一步将GenoType Mycobacterium CM试剂盒鉴定至分枝杆菌属的6株菌株进行了验证，这6株菌株分别为1株M.arupense、1株M.peregrinum、1株M.phocaicum、1株M.sinense、1株M.vanbaalenii、1株M.dioxanotrophicus。

三、MeltPro Myco试剂盒检测9株混合感染菌株的结果

9株经GenoType Mycobacterium CM试剂盒鉴定为混合感染的菌株，通过MeltPro Myco试剂盒鉴定后，证实了这9株菌株均为混合感染两种分枝杆菌，其中，8株混合感染MTBC和胞内分枝杆菌，1株混合感染MTBC和鸟分枝杆菌。

四、NTM菌株的菌种分布

经过3种鉴定方法的联合检测，从261株分析菌株中检测出213株NTM，占81.61%(213/261)，NTM的分离率为6.35%(213/3355)。在213株NTM菌株中，204株为单一NTM感染菌株，9株NTM与MTBC混合感染菌株，菌种分布情况见表2，140株(65.73%，140/213)胞内分枝杆菌(包括132株单一胞内分枝杆菌感染，以及8株MTBC和胞内分枝杆菌混合感染)，37株(17.37%，37/213)脓肿分枝杆菌，9株(4.22%，9/213)堪萨斯分枝杆菌，8株(3.75%，8/213)偶然分枝杆菌，5株(2.35%，5/213)鸟分枝杆菌(包括4株单独胞内分枝杆菌感染，以及1株MTBC和胞内分枝杆菌混合感染)，3株(1.41%，3/213)戈登分枝杆菌，3株(1.41%，3/213)龟分枝杆菌，2株(0.94%，2/213)瘰疬分枝杆菌，M.arupense、M.peregrinum、M.phocaicum、M.sinense、M.vanbaalenii和M.dioxanotrophicus各1株(0.47%，1/213)。在48株不含NTM的菌株中，有21株单一MTBC感染，27株分枝杆菌阴性。

讨 论

NTM是一种环境中普遍存在的微生物，大多数为条件致病菌，在免疫力功能正常和免疫功能低下的人群中均有可能发生感染，可引起局部(如皮肤和软组织、淋巴结、骨骼和肺等)或全身播散性感染[12-13]。根据NTM病相关治疗研究的报道，不同菌种的NTM对同一药品的抗性也有所差别[13-14]。不同地理位置NTM菌种的多样性有所差别，福建省位于中国东南沿海地区，当地的亚热带气候可能会影响NTM菌种分布的多样性[15-16]。

表2 213株NTM的菌种分布

一、NTM的菌种多样性分布

在PNB鉴定方法初步鉴定为NTM的261株菌株中，有81.61%的菌株被鉴定为NTM，共包含14个菌种。在所有NTM菌株当中，胞内分枝杆菌(65.73%)、脓肿分枝杆菌(17.37%)和堪萨斯分枝杆菌(4.22%)分离率排在前3位，为福建省的优势菌种。与中国其他地区相比，例如，在中国西南地区重庆市，脓肿分枝杆菌复合群(36.3%，53/146)、胞内分枝杆菌(26.0%，38/146)和偶然分枝杆菌(11.7%，17/146)是主要优势菌种[17]；在中国南部地区广东省，脓肿分枝杆菌(48.8%，458/938)、戈登分枝杆菌(22.5%，211/938)和胞内分枝杆菌(9.7%，91/938)是主要优势菌种[18]；在中国中部地区长沙市，胞内分枝杆菌(43.9%，381/867)、鸟分枝杆菌(24.1%，209/867)和龟-脓肿分枝杆菌复合群(21.7%，188/867)是主要优势菌种[19]；在中国北部地区北京市，胞内分枝杆菌(39.2%，51/130)、堪萨斯分枝杆菌(37.7%，49/130)和鸟分枝杆菌(6.9%，9/130)是主要优势菌种[20]，以上这些地区的NTM分布，无论是在优势菌种方面，还是在所有NTM当中的占比方面，均与福建省有很大的差别。此外，中国东部地区上海市的优势菌种为胞内分枝杆菌(31.3%，160/512)、脓肿分枝杆菌(28.3%，145/512)和堪萨斯分枝杆菌(18.6%，95/512)[21]，虽然优势菌种与福建地区一样，但是在所有NTM当中的占比差别显著。不同NTM菌种的分布可能具有明显的区域特征，即使在同一国家，在不同地理位置上NTM的菌种多样性分布会有所不同。

黄明翔等[22]分析了福州肺科医院2009年到2012年NTM的分离情况，在其研究数据中，NTM的临床分离率为10.20%(649/6362)，NTM中分离率排前3位的分别是胞内分枝杆菌(46.53%，302/649)，鸟分枝杆菌(21.26%，138/649)和脓肿分枝杆菌(12.48%，81/649)。本研究与其数据存在一定的差异：第一，本研究的NTM分离率为6.35%(213/3355)，明显低于上述研究的10.20%；第二，本研究的胞内分枝杆菌占比为65.73%(140/213)，明显高于上述研究的46.53%；第三，本研究NTM分离率排位前三的分别是胞内分枝杆菌(65.73%，140/213)、脓肿分枝杆菌(17.37%，37/213)和堪萨斯分枝杆菌(4.23%，9/213)，与上述研究中排位前三的NTM菌种存在明显差异。对于以上两者之间的差异，笔者认为可能的主要原因是菌株来源存在差异：本研究的菌株来源于福建省9个省级结核病耐药监测点和9个地市级疾控中心结核病实验室，而上述研究的菌株来源于福州肺科医院，福州肺科医院作为福建省最大的结核病诊治医院，所收治的患者情况比较复杂，复治或难治患者相对较多，因此，所分离的菌株分布可能会与本次研究有所差异。当然，以上猜测需要后续更多的研究进一步分析。

二、PNB鉴定方法与GenoType Mycobacterium CM试剂盒在NTM鉴定方面存在差异

本研究中，GenoType Mycobacterium CM 试剂盒总共检测到204株单一NTM感染菌株，9株混合感染菌株，以及48株菌株不含NTM(包含21株MTBC和27株分枝杆菌阴性)，而PNB鉴定方法将本研究的261株菌株全部鉴别为NTM，48株菌株试剂盒鉴定结果与PNB鉴定方法不一致，一方面的原因可能是PNB鉴定方法鉴定NTM存在假阳性，若与GenoType Mycobacterium CM 试剂盒作对比，PNB鉴定方法的假阳性率为18.39%(48/261)，与王建等[23]研究中的假阳性率15.05%(14/93)相近；另一方面的原因可能是GenoType Mycobacterium CM 试剂盒靶基因选择的问题，导致有些菌种的靶基因不易被扩增，造成假阴性的结果[11]。

三、罕见NTM菌种

本研究中，GenoType Mycobacterium CM试剂盒鉴定为分枝杆菌属的6株菌株经过测序验证，鉴定它们分别为M.arupense、M.peregrinum、M.phocaicum、M.sinense、M.vanbaalenii和M.dioxanotrophicus各1株，这6个菌种均为罕见NTM。其中，M.arupense和M.peregrinum这2个菌种被相关研究人员从国内的水源环境中分离出来[24]，M.phocaicum、M.sinense、M.vanbaalenii和M.dioxanotrophicus在国内还未见报道。国外有关报道认为M.arupense、M.peregrinum和M.phocaicum这3个菌种可能会造成肺部感染疾病[25-27]，而M.sinense、M.vanbaalenii和M.dioxanotrophicus在国外也还未见与人类疾病相关的报道。

四、混合感染菌株

除了上述情况外， 9株菌株GenoType Mycobacterium CM 试剂盒检测为混合感染，但无法鉴定至具体菌种，而DNA测序也无法鉴定混合感染菌株中的菌种。近期有研究报道，MeltPro Myco试剂盒能够鉴定MTBC和17种临床常见的NTM菌种，并且可以准确鉴定出混合感染菌株中含有的菌种[15]。上述9株菌株经过MeltPro Myco试剂盒检测， 8株为同时感染MTBC和胞内分枝杆菌，1株为同时感染MTBC和鸟分枝杆菌。该结果说明了在同一菌株中可能会存在两种或者两种以上菌的感染，这种菌株在本研究中的比例为3.45%(9/261)。因此，混合感染菌株的正确鉴定不容忽视，否则将导致患者的治疗出现延误。

综上所述，本研究结合了多种分子鉴定手段来进行分枝杆菌菌种的鉴定，以保证菌种鉴定的准确性，结果表明，胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌的分离率排在福建省NTM的前3位，为福建省的优势菌种，与中国其他地区有明显差别。本研究还鉴定出了6种罕见的NTM，这为国内罕见分枝杆菌的流行情况及其致病性研究提供了线索。此外，本研究也进一步揭示了分枝杆菌混合感染的现象时有发生，基于治疗的角度来看，混合感染菌株的准确鉴定不容忽视。然而，本研究纳入的菌株数量相对有限，菌株信息统计还不够完善，后续将开展更为广泛的研究，为我国NTM流行病学研究提供更多基础数据。

志谢福州市疾病预防控制中心(潘洁茹、刘杰)、福州市连江县医院(王志卫)、厦门市疾病预防控制中心(洪超)、厦门大学附属第一医院(马晓波)、福建省宁德市疾病预防控制中心(董其英)、福建省宁德市福鼎市医院(李步任)、福建省莆田市疾病预防控制中心(黄丽凡)、福建省莆田市仙游县医院(林晶)、福建省泉州市疾病预防控制中心(黄晓伟)、福建省泉州市晋江市医院(董芬芳)、福建省漳州市疾病预防控制中心(张添林)、福建省漳州市南靖县疾病预防控制中心(戴清全)、福建省龙岩市疾病预防控制中心(郑建莉)、福建省龙岩市武平县医院(郑才祥)、福建省三明市疾病预防控制中心(罗宏活)、福建省三明市尤溪县总医院(郑艳艳)、福建省南平市疾病预防控制中心(黄火寿)、福建省南平市邵武县疾病预防控制中心(魏文)在本研究菌株收集方面提供了帮助与指导。