抗耐药结核病新药吡法齐明通过醌氧化还原酶介导发挥作用的机制研究

张蕾 李媛媛 陈曦 刘海婷 徐建 王宁 丁杨明 陆宇

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的，严重危害人类健康的呼吸道传染性疾病，至今仍是造成死亡人数最多的单一传染病之一[1]。随着耐多药结核病(MDR-TB)的传播和广泛耐药结核病(XDR-TB)的出现，强效的一线抗结核药品作用受限，而二线抗结核药品又存在费用高、疗程长、治愈率低、不良反应大等问题。目前全球结核病的治愈率为83%，而MDR-TB和XDR-TB的治愈率则仅有54%(中国为41%)和30%[2]。现有抗结核药物不能满足临床治疗需求，迫切需要具有新作用机制的抗结核药物。

近年来氯法齐明(clofazimine，Cfz)的抗结核活性已得到证实，多项含Cfz的短程化疗方案均取得了令人瞩目的治疗效果，2019年的WHO耐多药或利福平耐药结核病治疗指南[3]和《中国耐多药和利福平耐药结核病治疗专家共识(2019年版)》[4]都把Cfz作为治疗耐药结核病的核心药品。但是，Cfz导致的皮肤红染等不良反应使得Cfz的广泛应用受到限制。吡法齐明(pyrifazimine，TBI-166)是在Cfz结构基础上改造获得的新型亚胺吩嗪类抗结核药品，是中国第一个拥有自主知识产权的抗结核新药。TBI-166的体外活性更高，且对药物敏感结核分枝杆菌、耐药结核分枝杆菌、胞内结核分枝杆菌和非复制期结核分枝杆菌均有效[5]。最重要的是，其引起的皮肤染色却比Cfz少，目前已开展Ⅱ期临床试验(登记号：CTR20202345)，具有临床应用价值。

本课题组对TBI-166的作用机制进行初步的探讨，证实了TBI-166可能与Cfz有相似的作用机制，通过累积活性氧(reactive oxygen species，ROS)发挥杀菌作用[6]。并且利用蛋白质组学技术量化分析结核分枝杆菌受到TBI-166作用后蛋白表达的改变，发现差异蛋白醌氧化还原酶(quinone oxidoreductase, QOR；A0A045HJH7)在TBI-166处理组各样本中均有显著变化。本研究是利用分子生物学的方法对MtbQOR蛋白进行表达纯化，鉴定TBI-166对MtbQOR介导的氧化还原反应的影响，同时研究了TBI-166处理结核分枝杆菌后NADPH/NADP+比值的变化以及结核分枝杆菌标准菌株及临床分离菌株内ROS含量的变化。对TBI-166的抗结核作用机制开展进一步的探索。

资料和方法

一、实验菌株

结核分枝杆菌标准株H37Rv(ATCC 27294)，MDR-TB 患者的结核分枝杆菌临床分离株菌株号为11195及11492(对TBI-166及Cfz耐药)、12897(对TBI-166及Cfz敏感)、15171(对TBI-166敏感，对Cfz耐药)由首都医科大学附属北京胸科医院/北京市耐药结核病重点实验室保存并提供，对TBI-166及Cfz的药物敏感性试验(简称“药敏试验”)通过微孔培养显色法(microplate alamar blue assay，MABA)进行测定。

二、实验药物

TBI-166[纯度≥99.0%，由中国医学科学院药物研究所(北京)黄海洪教授课题组提供]、异烟肼(美国Sigma公司；批号：060M0090；质量：50 g；纯度≥99.0%)、利福平(RFP；美国Sigma公司；批号：WXBB7288V；质量：5 g；纯度≥97.0%)。

三、仪器与试剂

1.仪器：Infinite 200多功能酶标仪(瑞士Tecan 公司)、Nuaire701二氧化碳恒温培养箱(美国Nuaire 公司)、GENEPRO多功能基因扩增仪(杭州博日科技有限公司)、DS-11FX超微量分光光度计(美国DeNovix公司)、Tanon-4200全自动数码凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)、AKTA pure 25蛋白纯化系统(美国Gene公司)、SYNERGY酶标仪(美国 BIOTEK 公司)、1730R微量高速冷冻离心机(美国Gene公司)、Max-Q8000低温摇床(美国Thermo公司)。

2.试剂：pET32a质粒(重庆优宝生物技术股份有限公司；批号：y32014)、BamHⅠ[宝生物工程(大连)有限公司；批号：AHG2027A]、XhoⅠ[宝生物工程(大连)有限公司；批号：AG60621A]、E.coli BL21(DE3)(北京全式金生物技术有限公司；批号：O20811)、细菌ROS检测试剂盒(上海贝博公司；批号：BB20081)、叔丁基过氧化氢(TBHP；美国Sigma公司；批号：SHBB7856V)、辅酶Ⅱ NADP(H)含量检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司；批号：20191223)、菲醌(上海麦克林生化科技有限公司；批号：C10005539)、NADPH(还原型辅酶Ⅱ；上海碧云天生物技术有限公司；批号：091919201106)。

四、MtbQOR蛋白表达与纯化

采用PCR方法从灭活的H37Rv菌株中扩增MtbQOR(Rv1454c)基因，并克隆至BamHⅠ和XhoⅠ限制位点之间的pET32a质粒，得到的蛋白在MtbQOR的N-末端含有硫氧还蛋白/His6标签，相对分子质量约为53 000。MtbQOR在Luria-Bertani培养基(含100 μg/ml氨苄青霉素)大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。当生长至对数生长期(A600 nm达到0.6)，用0.5 mmol/L IPTG诱导培养18 h。细胞在室温下8000×g离心机离心15 min，然后在含有25 mmol/L Tris、500 mmol/L NaCl、pH 8.0的裂解缓冲液中再悬浮和裂解。上清液在12 000×g离心机离心40 min，得到含有可溶性靶蛋白的上清液加载到Ni柱。靶蛋白使用含有25 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH值 8.0的洗脱缓冲液进行洗脱。将含有蛋白质的组分汇集在一起，进行浓缩除盐，并在-80 ℃下储存至进一步使用。通过SDS-PAGE估计蛋白质的纯度>95%。

五、TBI-166对MtbQOR介导的氧化还原反应影响

MtbQOR介导的氧化还原反应特异的以NADPH为H+供体，NADPH在波长340 nm下有特异吸收峰，通过酶标仪检测吸光度值(A340 nm)下NADPH下降程度(ΔA)可以反映MtbQOR介导的氧化还原反应发生程度。反应在25 ℃，150 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH值7.0，0.12 mmol/L NADPH，0.05 mg/ml MtbQOR，25 μmol/L底物混合体系中测定。通过添加含有MtbQOR蛋白质的相同缓冲溶液作为反应开始，立即测定波长340 nm下的初始吸光度值A1，在不加入TBI-166或加入不同浓度的TBI-166情况下测定20 min后波长340 nm下的吸光度值A2，计算ΔA=A1-A2[7-8]。

六、结核分枝杆菌ROS含量测定

H37Rv菌株和各临床分离菌株生长至对数生长期，对H37Rv菌株设置加TBI-166组(0.03、0.3、3 μg/ml)、加RFP组(0.025、0.25、2.5 μg/ml)、空白对照组及阳性对照组；对各临床分离菌株设置加TBI-166组(0.03、0.3、3 μg/ml)、空白对照组及阳性对照组，阳性对照组为TBHP处理组，在药物作用24 h后进行取样[9]。通过8000×g离心机离心10 min获得细菌培养物并重新悬浮，在O11探针中37 ℃避光孵育30 min。8000×g离心机离心10 min收集菌体，在磷酸盐缓冲液中洗涤，并在测量前再次重悬，将200 μl每个样品装入黑色底部透明96孔板中。设置激发波长488 nm，发射波长526 nm检测荧光值。

七、结核分枝杆菌NADPH/NADP+比值测定

采用辅酶Ⅱ NADP(H)含量检测试剂盒对结核分枝杆菌NADPH/NADP+比值进行测定。H37Rv菌株生长至对数生长期，设置加TBI-166组(0.03、0.3、3 μg/ml)及空白对照组，在药物作用6、12、24、48、96 h后进行取样。通过8000×g离心机离心10 min 获得细菌培养物，分别用酸性和碱性提取液提取结核分枝杆菌中的NADP+和NADPH。NADPH通过PMS的递氢作用，可以使氧化型噻唑蓝(MTT)还原为甲瓒，使用酶标仪在波长570 nm下检测吸光度值。利用6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原NADP+为NADPH，从而检测NADP+含量。进而计算两者比值。

八、统计学处理

结 果

一、MtbQOR蛋白表达、纯化

对经IPTG诱导的重组菌株BL21(DE3)-pET32a-Rv1454c进行SDS-PAGE分析，在相对分子质量约53 000处出现目的蛋白条带，而菌株BL21(DE3)及空载菌株BL21(DE3)-pET32a无此条带(图1)，表明Rv1454c基因在大肠杆菌中得到了成功表达。目的蛋白在细菌裂解上清和包涵体均有表达，收集上清用Ni-NTA亲和纯化柱纯化目的蛋白，通过Western Blot确定是目的蛋白(图2)并且通过SDS-PAGE确定得到的蛋白纯度>95%(图3)。

注 M：蛋白质相对分子质量标准；l：BL21(DE3)全菌；2:不含目的蛋白重组BL21(DE3)-pET32a全菌；3：上样缓冲液；4：未诱导重组BL21(DE3)-pET32a-Rv1454c全菌；5：诱导2 h重组BL21(DE3)-pET32a-Rv1454c全菌；6：诱导4 h重组BL21(DE3)-pET32a-Rv1454c全菌；7：诱导16 h重组BL21(DE3)-pET32a-Rv1454c全菌；8: 诱导18 h重组BL21(DE3)-pET32a-Rv1454c全菌图1 重组蛋白Rv1454c的SDS-PAGE电泳分析

注 M:蛋白质相对分子质量标准；1:Ni-NTA纯化后的Rv1454c蛋白图2 Ni-NTA纯化后的Rv1454c蛋白Western Blot验证

注 M:蛋白质相对分子质量标准；1:Ni-NTA纯化后的Rv1454c蛋白图3 纯化的重组蛋白Rv1454c SDS-PAGE电泳分析

二、MtbQOR介导的氧化还原反应监测

随着加入TBI-166浓度的增高，NADPH下降的程度(ΔA)更大。与空白对照组ΔA(0.316±0.032)比较，0.03、0.3、3 μg/ml TBI-166组ΔA(0.506±0.107、0.531±0.054、0.801±0.079)差异有统计学意义(t=-3.799，P<0.05；t=-7.634，P<0.01；t=-12.683，P<0.01) (图4)。

注 ΔA为波长340 nm下NADPH吸光度的下降程度， a：P<0.05，b：P<0.001图4 不同浓度TBI-166对MtbQOR介导的氧化还原反应影响

注 A～E图分别是不同浓度TBI-166作用6、12、24、48及96 h的NADPH/NADP+比值图5 不同浓度TBI-166作用H37Rv不同时间NADPH/NADP+比值

三、不同浓度TBI-166作用H37Rv标准株后NADPH/NADP+比值测定

不同浓度TBI-166作用H37Rv标准株后分别对作用6、12、24、48、96 h的NADPH/NADP+的比值进行检测，结果显示(图5)，在6、12、24及48 h与同一检测时间点空白对照组相比，加入TBI-166药物的各处理组NADPH/NADP+的比值均降低，空白组的NADPH/NADP+的比值为1.728±0.384，而加TBI-166组的NADPH/NADP+比值为0.847±0.229。并且，随着作用时间的延长，NADPH/NADP+的比值逐渐降低，在TBI-166作用48 h之后，NADPH/NADP+的比值达到最低，而在96 h，各TBI-166组的NADPH/NADP+的比值上升接近空白对照组的比值(图6)。

图6 不同浓度TBI-166作用H37Rv后NADPH/NADP+比值随时间变化曲线

注 A：不同浓度TBI-166作用H37Rv 24 h后ROS荧光值；B：不同浓度RFP作用H37Rv 24 h后ROS荧光值；C：不同浓度TBI-166作用菌株12897 24 h后ROS荧光值；D：不同浓度TBI-166作用菌株15171 24 h后ROS荧光值；E：不同浓度TBI-166作用菌株11492 24 h后ROS荧光值；F：不同浓度TBI-166作用菌株11195 24 h后ROS荧光值，a:P<0.05，b:P<0.01，c:P<0.001图7 不同浓度TBI-166刺激各菌株24 h菌体ROS荧光值

四、不同浓度TBI-166刺激结核分枝杆菌各菌株后的菌体细胞ROS含量测定

TBI-166刺激H37Rv标准株及各临床分离株后的菌体细胞荧光强度值在刺激24 h后达到最大，记录数据并进行单因素ANOVA检验。在H37Rv标准株中，TBI-166刺激组ROS荧光值为23 072±2584，明显高于空白对照组(8282±448)，差异有统计学意义(F=33.334，P<0.01)。不同浓度的RFP刺激均不能引起ROS的上升(图7A～B)，与空白对照组相比差异无统计学意义(F=261.392，P>0.05)。在菌株号为12897菌株中，TBI-166刺激组ROS荧光值为18 369±3118，明显高于空白对照组(12 268±2735)(图7C)，差异有统计学意义(F=5.026，P<0.05)。在菌株号为15171菌株中，0.03、0.3 μg/ml TBI-166刺激菌体ROS含量与空白对照组比较差异无统计学意义 (F=122.601，P>0.05)，3 μg/ml TBI-166刺激组ROS荧光值为17 572±249，明显高于空白对照组(11 109±343)(图7D)，差异有统计学意义(F=122.601，P<0.01)。菌株号为11492及11195菌株，在这两株菌中，TBI-166刺激组与空白对照组相比荧光值接近，差异无统计学意义(F=161.440，P>0.05；F=44.788，P>0.05)，而阳性对照TBHP组可以明显刺激菌体产生ROS(图7E～F)，差异有统计学意义(F=161.440，P<0.01；F=44.788，P<0.01)。

讨 论

TBI-166是Cfz的结构改造物，在临床前研究中，展现了与Cfz相当的抗结核活性，并且降低皮肤红染不良反应[10]。在比格犬体内的药代动力学研究表明其属于低清除率药物[11]。在BALB/c小鼠中，与对照方案INH+RFP+PZA相比，5种含TBI-166的方案在治疗4周后显示出更好的疗效[12]。最新一项研究表明，每日一次给予TBI-166比间歇给药方案更有效[13]，TBI-166拥有替代Cfz进入临床治疗的潜能。本研究对抗耐药结核新药TBI-166通过MtbQOR介导，累积ROS的机制进行探讨，为TBI-166 Ⅱb期临床试验的组合方案提供合理充分的理论依据。

MtbQOR为醌氧化还原酶，以NADPH为H+供体，介导的氧化还原反应过程中会生成活性氧自由基，包括超氧阴离子、过氧化物和羟自由基[14]。本研究发现加入不同浓度的TBI-166均可以增强MtbQOR介导的还原反应，3 μg/ml TBI-166对MtbQOR介导的氧化还原中NADPH下降程度是空白对照组的2.5倍，0.03、0.3 μg/ml TBI-166对MtbQOR介导的氧化还原中NADPH下降程度是空白对照组的1.6、1.7倍。Cfz是具有氧化还原活性的分子，其可在NDH-2醌氧化还原酶的作用下被还原，生成活性还原型Cfz，接着还原型Cfz在O2的作用下生成活性氧物质，通过累积ROS发挥抗结核作用[15]。在本研究中，我们发现TBI-166可以增强MtbQOR介导的氧化还原反应，因此推测，TBI-166 与MtbQOR的底物醌竞争电子被还原，被还原后的TBI-166随后氧化并产生超氧化物和过氧化氢之类的ROS发挥作用。

NADPH是细胞内抗氧化防御系统的重要组成成分，在细胞防御ROS损伤方面起着重要的作用，NADPH的氧化形式是NADP+，测定结核分枝杆菌菌体内的NADPH/NADP+比值一方面可以反映菌体内氧化应激状态[16]，另一方面代表MtbQOR催化反应的发生方向。在本研究中，测定不同浓度TBI-166处理H37Rv标准株后显示TBI-166可以降低结核分枝杆菌内NADPH/NADP+的比值，证实结核分枝杆菌内反应向着消耗NADPH，生成NADP+的方向进行，结核分枝杆菌受到TBI-166作用后，菌体内氧化还原水平活跃，提示MtbQOR的还原反应活跃，这与TBI-166增强MtbQOR介导的氧化还原反应研究结果一致。并且我们发现在96 h NADPH/NADP+比值在TBI-166处理组与空白对照组接近，这可能与TBI-166作用后结核分枝杆菌的代谢代偿有关，经过药物处理后的结核分枝杆菌为了抵抗TBI-166的作用，经过代偿活动，产生更多的NADPH，在96 h使得NADPH/NADP+的比值恢复到正常水平。

结核分枝杆菌H37Rv菌体内ROS的含量在TBI-166作用24 h后有显著的变化，与空白对照组相比有2倍左右的上升，这与文献报道一致[6]。本研究发现不同浓度的RFP作用H37Rv菌株后并不能引起ROS含量的变化，这与RFP可能具有抗氧化应激能力有关[17]，提示结核分枝杆菌内ROS的累积可能是TBI-166特异性发挥作用的途径。此结论在结核分枝杆菌临床株中得到证实，对TBI-166 耐药的菌株(11492、11195)中均不能观察到ROS含量的上升，而TBI-166敏感的菌株中(12897)观察到与H37Rv相似的结果。

值的注意的是，本研究发现3 μg/ml TBI-166增强MtbQOR介导的氧化还原反应明显高于0.03、0.3 μg/ml TBI-166，而不同浓度TBI-166作用H37Rv后NADPH/NADP+的比值接近，提示0.03、0.3 μg/ml TBI-166作用结核分枝杆菌后可能不仅通过MtbQOR途径消耗NADPH，还存在其他消耗NADPH的方式。在ROS实验中，笔者观察到菌株15171中，0.03、0.3 μg/ml TBI-166对菌体ROS的刺激作用较3 μg/ml TBI-166弱，进一步分析菌株15171对Cfz耐药，提示0.03、0.3 μg/ml TBI-166与Cfz的作用机制存在交叉部分。NDH-2贡献电子是结核分枝杆菌呼吸链的起始，Cfz通过竞争NDH-2贡献电子累积ROS而影响结核分枝杆菌呼吸链[15, 18]，NADPH可以提供H给NAD+生成NADH参与氧化呼吸链的H传递[9]。因此推测0.03、0.3 μg/ml TBI-166可能通过降低NADPH的相对含量，使得NADPH提供给NAD+的H变少，进而使进入氧化呼吸链的NADH含量变少，发挥抗结核作用。

根据本研究结果，发现TBI-166增强MtbQOR 介导的氧化还原反应，累积ROS发挥抗结核作用，并且可能通过降低NADPH/NADP+的比值，降低NADPH的相对含量影响结核分枝杆菌呼吸链(图8)。TBI-166的抗结核作用机制研究，将进一步充实和丰富吩嗪类药物抗结核作用机制的理论依据；为其后期的临床合理组合用药提供理论依据；对新型药物靶标的发现及新型抗生素的研发具有一定的潜在借鉴和应用价值，对将来临床分子诊断等具有重要的潜在应用价值。

注 O2：氧；ROS：活性氧；QOR：醌氧化还原酶；TBI-166red：还原型TBI-166；TBI-166ox：氧化型TBI-166；NADPH：还原型辅酶Ⅱ；NADP+：氧化型辅酶Ⅱ；Electron Transport Chain：电子呼吸链；NADH：还原型辅酶Ⅰ；NAD+：氧化型辅酶Ⅰ；ADP：二磷酸腺苷；ATP：三磷酸腺苷；Pi：磷酸基团图8 TBI-166发挥抗结核作用的可能机制

本研究局限性在于：(1)TBI-166增强MtbQOR 介导的氧化还原反应，可能包含两个作用途径，TBI-166可能被MtbQOR还原，消耗更多的NADPH；也有可能是通过TBI-166与MtbQOR蛋白的活性位点结合，增强QOR蛋白的活性从而增强MtbQOR介导氧化还原反应，但具体的机制尚需进一步的探讨。(2)结核分枝杆菌菌体内累积一定含量的ROS，可能导致结核分枝杆菌DNA损伤，氧化应激异常，代谢紊乱，从而导致结核分枝杆菌死亡[19]，需要进一步研究ROS的累积是如何造成结核分枝杆菌死亡的。