LncCCAT1竞争性结合miR-583p通过调节MAPK13的表达调控乳腺癌细胞干细胞样特性

2021-06-02朱晓磊吴晓琴吴池华

安徽医科大学学报 2021年5期

庄欢，朱晓磊，吴晓琴，张庆，方靖，吴池华

乳腺癌是全世界女性与癌症相关的死亡的主要原因，全世界每年有将近140万妇女被诊断出患有这种疾病，每年超过45万例死亡。乳腺癌最常用的治疗方法是手术切除肿瘤，辅以辅助化疗或放疗。尽管在乳腺癌的早期检测和治疗方面取得了进步，但乳腺癌的发病率和死亡率仍逐年上升，迫切需要发现乳腺癌的诊断和治疗新靶标用于治疗乳腺癌。

微小RNA( microRNA，miRNA)是一类小分子非编码调控RNA，在乳腺癌中起癌基因或抑癌作用。结肠癌相关转录因子1 (colon cancer associated transcript 1，CCAT1)是2012年在结肠癌中发现的一种新型LncRNA，被证实在乳腺癌中高表达，与乳腺癌组织分化程度，TNM分期和淋巴结转移相关。相关研究表明丝裂原活化蛋白激酶13(MAPK13)在妇科肿瘤干细胞中高表达，对于维持肿瘤干细胞致癌能力有一定的作用。但CCAT1与MAPK13对乳腺癌发生发展的分子机制尚不清楚。该文旨在探究LncCCAT1竞争性结合miR-583p通过调节MAPK13的表达对MCF-7细胞干性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

RPMI 1640培养基(批号：61870-127)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，批号：26400-036)、青-链霉素(批号：15140-122)、胰蛋白酶(批号：25200-056)、F12培养基(批号：21700-075)购自美国Gibco公司；牛血清白蛋白(Bovine albumin，BSA，批号：ST025)、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS，批号：C0221A)、LipoRNAi转染试剂(批号：C0535)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号：P0012)购自上海碧云天生物技术研究所；荧光素酶(批号：L7840)检测试剂盒购自北京solarbio公司；Anti MAPK13(货号：ab236738)、SOX2(货号：ab97959)、NANOG(货号：ab80892)、ALDH1(货号：ab87117)、GAPDH(货号：ab9485)购自英国Abcam公司。

1.2 细胞处理

人乳腺癌细胞MCF-7来源于美国典型培养物保藏中心，用含10% FBS和1%青-链霉素的1640培养基，在37 ℃、5% CO条件下培养。参照胡楠等方法分离乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells，BCSCs)，用PBS洗去血清，悬浮培养于无FBS的含5 mg/L胰岛素，10 μg/L重组人碱性成纤维细胞生长因子，20 μg/L表皮细胞生长因子，0.04% BSA的无酚红DMED-F12培养基中。传代时每次1×10个细胞接种于25 cm培养瓶中，用低速离心机分离微球，胰酶消化，离心除去胰酶，重悬于无血清培养基中。微球直径长至80 μm之前传代，每5 d传代1次。

1.3 q-PCR法

使用TRIzol试剂按照试剂说明书从MCF-7细胞中分离总RNA，然后用BeyoRTcDNA第一链合成试剂盒将总RNA逆转录合成为cDNA，用BeyoFastSYBR Green qPCR Mix在PCR仪上进行测定，用2方法计算。检测贴壁细胞、悬浮球细胞和再贴壁细胞中CCAT1和miR-583p表达水平。

1.4 细胞分组

为了防止脱靶效应，设计了3对shRNA序列干扰CCAT1的表达，通过q-PCR检测选择效果最好的sh-CCAT1-2进行后续试验。用miR-583p mimc或miR-583p inhibitor转染MCF-7细胞以过表达或低表达miR-583p，q-PCR检测miR-583p表达水平。取对数生长期的MCF-7细胞，构建shRNA CCAT1载体，采用LipoRNAi转染试剂将sh-CCAT1和miR-583p inhibitor单独或联合转染MCF-7细胞，将细胞随机分为4组：对照、shRNA-CCAT1-2、miR-583p inhibitor和shRNA-CCAT1-2+miR-583p inhibitor组。

1.5 荧光素酶报告实验

为了检测CCAT1是否为miR-583p的直接下游靶基因，选用荧光素酶报告分析。通过miRDB预测LncCCAT1和miR-583p的靶向关系，构建野生型和突变型CCAT1 3、UTR荧光素酶报告基因质粒。按照荧光素酶检测试剂盒进行检测。

1.6 ALDEFLUOR分析

采用ALDEFLUOR分析方法对乳腺癌细胞MCF-7 ALDH活性进行分析，根据ALDEFLUOR试剂盒说明书进行检测：40 μm滤器收集细胞球，胰酶消化8 min，反复吹打10次悬浮于含5 μl的ALDH底物BodipyTM-aminoacetaldehyde中，37 ℃孵育40 min。将等分试样加入5 μl处理过的ALDH抑制剂DEAB，重悬于孵育缓冲液中，用流式细胞仪进行检测。

1.7 成球实验

将各组细胞经流式细胞仪计数后铺至超低黏附96孔板。每孔100 μl F12成球培养基，含10个活细胞，各铺10个复孔。静置培养14 d后倒置显微镜下观察成球直径。

1.8 Western blot

取对数生长期的各组细胞，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行总蛋白提取，用BCA试剂盒测定蛋白质含量。提取等量的蛋白质样品， 100 ℃变性5 min，SDS-PAGE凝胶电泳法分离并转移至PVDF膜，4 ℃条件下加入相应一抗并孵育过夜，4 ℃下加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h，最后加入发光液，曝光处理。ImageJ软件统计灰度值。

1.9 MAPK13过表达对MCF-7细胞的影响

通过miRDB预测MAPK13和miR-583p的靶向关系，构建慢病毒LV-MAPK13并转染MCF-7细胞过表达MAPK13，q-PCR检测MAPK13水平。采用LipoRNAi转染试剂将shRNA-CCAT1-2和LV-MAPK13单独或联合转染MCF-7细胞，将细胞随机分为4组：对照、shRNA-CCAT1-2、LV-MAPK13和shRNA-CCAT1-2+LV-MAPK13组，shRNA-CCAT1-2组转染shRNA-CCAT1-2，LV-MAPK13组细胞转染LV-MAPK13，shRNA-CCAT1-2+LV-MAPK13组细胞同时转染shRNA-CCAT1-2和LV-MAPK13。Western blot检测MAPK13、SOX2、NANOG、ALDH1蛋白表达水平。

2 结果

2.1 LncCCAT1和miR-583p表达水平

通过q-PCR检测CCAT1和miR-583p表达水平结果如图1所示，与贴壁细胞相比较，悬浮球细胞CCAT1表达水平升高(

=1.741，

<0.05)，miR-583p表达水平降低(

=1.564，

<0.05)。

2.2 miR-583p和CCAT1靶向关系

通过q-PCR检测3个CCAT1 shRNA中CCAT1水平结果如图2B所示，与对照组相比，shRNA-CCAT1-1、shRNA-CCAT1-3组CCAT1水平降低(

=59.15，

<0.05)，shRNA-CCAT1-2组CCAT1水平降低(

=1.381，

<0.01)，选择shRNA-CCAT1-2进行后续实验；分别用miR-583p mimic或miR-583p inhibitor转染MCF-7细胞以过表达或低表达miR-583p，q-PCR检测miR-583p表达水平结果如图2C、D所示，与对照组相比，miR-583p mimc组miR-583p表达水平升高(

=1.049，

<0.001)，miR-583p inhibitor组miR-583p表达水平升高(

=1.299，

<0.01)；通过shRNA-CCAT1-2和miR-583p inhibitor单独或联合转染MCF-7细胞，q-PCR法检测miR-583p的表达情况结果如图2E所示，与对照组相比，shRNA-CCAT1-2组miR-583p表达水平升高(

=1.709，

<0.01)，miR-583p inhibitor组miR-583p表达水平降低(

=1.299，

<0.01)。与miR-583p inhibitor组相比较，shRNA-CCAT1-2+miR-583p inhibitor组miR-583p表达水平升高(

=1.325，

<0.01)。为明确miR-583p对CCAT1的靶向关系，采用荧光素酶实验检测，搜索NCBI数据库获得CCAT1 3′UTR序列如图2A所示，CCAT1 WT加入miR-583p mimic处理后荧光素酶活性降低(

=2.441，

<0.01，图2F)，结果证明miR-583p和CCAT1存在直接靶向作用关系。

2.3 LncCCAT1竞争性结合miR-583p降低MCF-7细胞ALDH活性及SOX2、NANOG、ALDH1蛋白表达水平

通过ALDEFLUOR分析检测干细胞和祖细胞的酶标记物乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase，ALDH)活性结果如图3A所示，对照组ALDH活性高于shRNA-CCAT1-2组，低于miR-583p inhibitor组。shRNA-CCAT1-2+miR-583p inhibitor组ALDH活性低于miR-583p inhibitor组；通过Western blot检测各组细胞SOX2、NANOG、ALDH1蛋白表达水平结果如图3B所示，与对照组相比，shRNA-CCAT1-2组SOX2、NANOG、ALDH1蛋白水平降低(

=1.519、1.550、2.250，

<0.05)，miR-583p inhibitor组SOX2、NANOG、ALDH1蛋白水平升高(

=6.913、4.000、4.120，

<0.05)。与miR-583p inhibitor组相比，shRNA-CCAT1-2+miR-583p inhibitor组SOX2、NANOG、ALDH1蛋白水平降低(

=2.792、2.208、2.556，

<0.05)。

图1 LncCCAT1和miR-583p表达水平

图2 miR-583p和CCAT1靶向关系

图3 LncCCAT1竞争性结合miR-583p对MCF-7细胞ALDH活性及SOX2、NANOG、ALDH1蛋白表达水平的影响

2.4 LncCCAT1竞争性结合miR-583p降低MCF-7细胞成球直径

通过成球实验检测各组细胞成球直径结果如图4所示，与对照组相比，shRNA-CCAT1-2组成球直径降低(

=1.933，

<0.05)，miR-583p inhibitor组成球直径升高(

=4.882，

<0.05)。与miR-583p inhibitor组相比，shRNA-CCAT1-2+miR-583p inhibitor组成球直径降低(

=2.774，

<0.05)。

2.5 MAPK13过表达对MCF-7细胞的影响

为明确miR-583p对MAPK13的靶向关系，搜索NCBI数据库获得MAPK13 3′UTR序列如图5A所示，采用荧光素酶实验检测，MAPK13 wt加入miR-583p mimic处理后荧光素酶活性降低(

=1.889，

<0.01，图5B)，表明miR-583p与MAPK13存在直接靶向作用关系；构建慢病毒LV-MAPK13并转染MCF-7细胞过表达MAPK13，q-PCR检测各组细胞MAPK13水平结果图5C、D所示，与贴壁细胞相比，悬浮球细胞MAPK13水平升高(

=2.053，

<0.01)。与对照组相比，LV-MAPK13组MAPK13水平升高(

=1.604，

<0.001)；通过Western blot检测各组细胞MAPK13、SOX2、NANOG、ALDH1蛋白表达水平结果如图5E所示，与对照组相比，shRNA-CCAT1-2组LV-MAPK13、SOX2、NANOG、ALDH1蛋白水平降低(

=1.550、1.519、1.550、2.250，

<0.05)，LV-MAPK13组MAPK13、SOX2、NANOG、ALDH1蛋白水平升高(

=1.391、1.889、1.911、1.375，

<0.05)。与LV-MAPK13组相比，sh-CCAT1+MAPK13组MAPK13、SOX2、NANOG、ALDH1蛋白水平降低(

=1.237、1.570、1.587、1.225，

<0.05)。

图4 LncCCAT1竞争性结合miR-583p对MCF-7细胞成球直径的影响

3 讨论

长链非编码RNA是一类长度超过200个核苷酸序列的非编码RNA，其异常表达与多种恶性肿瘤的生物学行为密切相关,如细胞增殖、侵袭和自噬等。Han et al发现CCAT1在三阴性乳腺癌肿瘤组织及细胞系中高表达，促进三阴性乳腺癌细胞的增殖、侵袭及迁移。LncRNA和miRNA间存在着紧密的调控关系，LncRNA可作为一种竞争性内源RNA与miRNA相互作用，参与靶基因的表达调控，已被证实在乳腺癌的发生、维持、转移及耐药中起重要作用。Lai et al表明CCAT1下调通过负向调控miR-148b表达，减少癌细胞集落形成率，促进细胞凋亡，从而提高乳腺癌细胞的放射敏感性。

肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中具有自我更新能力的细胞，其可分化成为不同家族的肿瘤细胞构成整个肿瘤。肿瘤细胞获得干细胞表型后具有较强的成球能力，并分化成其他类型的肿瘤细胞，肿瘤干细胞表型的获得是恶性肿瘤重要的生物学特性，也是肿瘤复发的重要因素之一。靶向肿瘤干细胞是治疗癌症的有效途径之一。本文表明，沉默CCAT1表达降低MCF-7细胞成球直径，抑制miR-583p表达则升高MCF-7细胞成球直径，并且减弱sh-CCAT1对MCF-7细胞成球直径的抑制作用，表明CCAT1能升高MCF-7细胞成球直径，并且其作用机制与其下调miR-583p表达有关。

P38δ MAPK也称为MAPK13，是脂肪细胞分化的主要候选基因。p38蛋白激酶是MAPK通路中控制炎症反应最重要的一条，通过介导癌细胞黏着、增强乳腺癌细胞运动性等机制，促进乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移。SOX2是SOX基因家族的一员，是癌症干细胞标志物，在维持干细胞多能性方面起着重要作用，参与肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭、转移、耐药、复发等过程。Wang et al表明SOX2在乳腺癌组织中高表达。NANOG是含同源结构域的转录因子，在胚胎干细胞干性维持和自我更新中起作用，在干细胞中表达，在分化成熟细胞中表达缺失，可促进肿瘤的转移，相关研究表明NANOG在乳腺癌癌组织中表达升高。ALDH1属于细胞内乙醛氧化脱氢酶，是干细胞生长、分化的必需物质，可作为肿瘤干细胞的标记物。研究表明乳腺癌细胞ALDH1表达上调, 则其增殖分化能力、集落形成能力、黏附能力、迁移能力和侵袭能力都会不同程度的增强。本文显示沉默CCAT1的表达可抑制MAPK13、SOX2、NANOG、ALDH1蛋白的表达，miR-583p inhibitor或LV-MAPK13能明显减弱sh-CCAT1对细胞SOX2、NANOG、ALDH1蛋白表达的抑制作用。提示沉默CCAT1表达后，CCAT1对miR-583p或LV-MAPK13的抑制作用消失，miR-583p或MAPK13的表达抑制SOX2、NANOG、ALDH1蛋白表达，表明CCAT1高表达可通过下调miR-583p或MAPK13的表达抑制SOX2、NANOG、ALDH1蛋白的表达，从而抑制MCF-7细胞干细胞样特性。