大鼠心肌细胞PTEN基因的表达情况及沉默对其氧糖剥夺/复氧模型耐受能力的影响

雷莹 陈毅

心脑血管疾病已成为威胁人类健康的第一杀手。据我国卫计委2013 年大城市居民死亡原因统计,心脏病排在第二位。随着人们生活水平的提高以及生活方式的改变,我国心血管疾病的发生率还会有上升趋势。急性心肌梗死发生时血液供应阻断30 min 以上即可导致心肌细胞不可逆的损伤甚至死亡,及时恢复血供被视为挽救部分心肌细胞功能的重要措施［1,2］。然而,心肌得到血液再灌注后,不仅功能未得到恢复,反而使心肌损伤加重,出现心律失常、梗死面积扩大等病变［3,4］。心梗后损伤局部会形成缺血缺氧微环境,炎症介质渗出浸润,还有再灌注损伤等等,都不利于心肌细胞在损伤区域的存活,如果能提高心肌细胞的存活能力,将可能明显提高介入治疗开通临床心肌梗死血管后细胞存活率,从而达到更加的治疗效果。PTEN 基因最先是作为抑癌基因被发现的,研究证实PTEN 基因能有效抑制肿瘤细胞的生长并具有特异性磷酸酶活性。新近研究还发现PTEN 基因还有促进细胞凋亡作用,其作用机制是通过抑制蛋白激酶B(Akt)途径而使Bcl-2 蛋白表达增加。因此本研究设计通过RNA 干扰抑制体外培养的大鼠心肌细胞的PTEN 基因,从而促进心肌细胞的生长能力和抗凋亡能力,提升心肌细胞对心肌梗死区域缺血缺氧微环境的耐受能力,对抗炎症介质渗出和再灌注损伤,从而为临床心肌梗死区域的心肌细胞存活提供新的治疗思路。

1 材料与方法

1.1 材料 SD 大鼠［许可证号:scxk(沪)2016-0001］,兔抗鼠ɑ-Sarcomeric Actin一抗,PTEN引物(TAKARA),PTEN 基因的特异siRNA(Qiagen 公司设计合成),改良蒂罗德溶液［各种成分含量：氯化钠(NaCl)：136.9 mmol/L,氯化钾(KCl)：2.68 mmol/L,十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12 H2O)：8.1 mmol/L,磷酸二氢钾(KH2PO4)：1.47 mmol/L,氯化钙(CaCl2)：0.9 mmol/L,六水氯化镁(MgCl2·6 H2O)：0.49 mmol/L］。

1.2 方法

1.2.1 大鼠心肌体外分离、纯化和扩增培养 取出生1～3 d 的SD 大鼠8 只,乙醚吸入麻醉后,消毒,取出心脏,用4℃无菌的 D-Hanks 缓冲液清洗干净,在预冷的无菌培养皿中将心脏剪成约1 mm 大小组织块(全程在冰盒上操作)。通过消化、离心、重悬细胞、过滤、贴壁培养2 h,收集未贴壁的细胞悬液,接种于培养皿,接种后48 h 首次换液,培养5 d。获得贴壁生长的原代心肌细胞。再通过传代,获得足够数量的心肌细胞。

1.2.2 对获得的心肌细胞进行鉴定 对心肌细胞胞浆内ɑ-横纹肌肌动蛋白免疫荧光染色,对心肌细胞进行鉴定。

1.2.3 实验分组 将获得的心肌细胞根据实验要求分为：对照组：为空白对照组,未进行脂质体法(Lipofectamin2000)转染,其他培养条件一样；阴性对照组：用脂质体法转染同一公司设计的无意义的siRNA；PTEN 干扰组：用脂质体法转染Qiagen 公司设计合成PTEN 基因特异的siRNA。

1.2.4 PTEN 基因沉默 Qiagen 公司设计合成针对PTEN 基因的特异siRNA,合成3 条,通过公司检测,选取其中1 条沉默效率达到90%以上的特异siRNA 用于实验,并检测证明沉默有效时间为4～10 d。同时公司设计合成提供的无意义的siRNA,用于阴性对照,其序列见表1。用脂质体法转染于心肌细胞,并检测 PTEN mRNA 的表达变化情况。

表1 Qiagen 公司设计合成siRNA 序列

1.2.5 RT-PCR 法检测PTEN mRNA 提取各实验组的心肌细胞总RNA,按RT-PCR 试剂盒操作说明操作、扩增、电泳、显色、扫胶。检测干扰前后PTEN mRNA表达的变化情况。［注：PTEN 基因的引物序列：上游为5'-CCAATGGCTAAGTGAAGACGACAA-3',下游为5'-CATAGCGCCTCTGACTGGGAATA-3',内参基因为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)］

1.2.6 模型制备和条件培养 各组细胞培养液更换为改良蒂罗德溶液。置入三气缺氧培养箱,连续充以90%氮气(N2),9%二氧化碳(CO2)和1%氧气(O2)混合的三种气体,培养4 h 后取出,更换成常规培养液,在正常培养条件继续培养2 h 取出各组细胞,制备成细胞培养氧糖剥夺/复氧模型。

1.2.7 对条件培养后的各组细胞进行细胞凋亡检 测 取氧糖剥夺/复氧模型条件培养后的各组细胞各 1 瓶,消化,离心,收集细胞,重悬计数。使用Annexin V 凋亡试剂盒对各组细胞进行操作,上流式细胞仪,检测各组细胞凋亡数量。

2 结果

2.1 倒置显微镜观察培养的大鼠心肌细胞形态 贴壁生长的心肌细胞呈梭形、多边形或不规则形态,偶尔可见心肌细胞搏动,细胞生长扩增后可互相连接交织成网状,形成单层心肌细胞或细胞簇。见图1。

图1 大鼠心肌细胞

2.2 大鼠心肌细胞鉴定 大鼠心肌细胞鉴定：对心肌细胞胞浆内ɑ-横纹肌肌动蛋白免疫荧光染色,对心肌细胞进行鉴定。通过荧光显微镜下可见心肌细胞胞浆内绿色荧光,认为大鼠心肌细胞胞浆内ɑ-横纹肌肌动蛋白高表达。见图2。

图2 免疫荧光染色

2.3 PTEN 基因的表达情况检测结果 使用RT-PCR法对各实验组细胞PTEN mRNA 进行检测,检测结果示RNA 干扰组中PTEN mRNA 表达明显减弱,提示通过PTEN 基因的特异siRNA 对心肌细胞转染后能有效沉默心肌细胞的PTEN 基因,对照组和阴性对照组PTEN基因表达无明显变化。见图3。

图3 RT-PCR 结果

2.4 细胞凋亡检测 使用流式细胞仪对条件培养后的各组细胞进行细胞凋亡检测,结果显示：氧糖剥夺/复氧模型条件培养后的各组细胞均可见明显凋亡,RNA干扰组凋亡细胞计数要明显少于对照组和阴性对照组,提示PTEN 基因特异的siRNA 对心肌细胞的PTEN 基因有效的沉默能抑制细胞凋亡。见图4。

图4 氧糖剥夺/复氧模型条件培养前、后各组细胞凋亡情况检测

3 讨论

心血管系统疾病是危害人类健康的主要疾患之一,其发病率高,危害性大,预后差一直困扰者世界各国的研究人员和医务人员。急性心肌梗死发生时血液供应阻断可导致心肌细胞缺血缺氧,能量供应中断,炎症介质浸润,出现心肌细胞凋亡、坏死,瘢痕组织形成,心肌收缩能力下降,导致心功能下降,严重者危及生 命［5］。细胞凋亡现象是一种主动的细胞消亡过程。往往是由细胞接受某种信号或受到某些因素刺激下产生的。相关研究发现在心肌梗死后梗死区也存在细胞凋亡现象,并且发现梗死区细胞凋亡率更高于非梗死 区,并认为心肌缺血是心肌细胞凋亡强有力的诱导因素［6］。近年研究主要集中在抑制心肌细胞凋亡来恢复心功能方面,并提出特异性和非特异性的抗凋亡治疗在预防和治疗心肌梗死后的心肌重塑和心力衰竭中发挥重要的作用［7］。Zhao 等［8］认为,缺血诱发的心肌细胞凋亡在左室收缩功能降低方面起到了重要的作用,抑制心肌细胞凋亡可减轻心肌缺血损害、改进心功能。

PTEN 基因是1997 年克隆出的第一个具有特异性磷酸酶活性新型肿瘤抑制基因,能有效抑制肿瘤细胞的生长。该基因具有广泛的同源性。PTEN 基因具有促进细胞凋亡作用,其沉默能促进细胞增殖和更新,研究发现PTEN 基因能通过抑制细胞周期相关基因来调节细胞周期的进展,相关研究通过基因敲除法敲除p53和PTEN 双重基因,导致Myc 基因高表达,从而抑制分化,维持持续的细胞更新［9-11］。同时,PTEN 基因还有促进细胞凋亡作用,通过沉默PTEN 基因可抑制细胞凋亡,提升细胞抗凋亡能力,但其机制尚未明确［12］。因此,本项目选择对心肌细胞的PTEN 基因进行修饰。发现PTEN 基因沉默后的细胞对氧糖剥夺/复氧模型有较强的耐受能力。

RNA 干扰是一种由双链RNA 介导的序列特异性基因沉默现象［13］。其特点包括特异性高,效果明确,同时具有时效性。所以本研究选择通过脂质体法对体外培养的心肌细胞继续PTEN 基因特异的siRNA 转染,转染成功后检测其沉默效率,发现沉默效果可达90%以上,但siRNA 在细胞能不稳定,逐渐被细胞降解排除体外,细胞恢复正常,因此RNA 干扰是一种有效的、短暂性的基因沉默手段。这是本实验设计的关键,PTEN 基因作为抑癌基因,其长期沉默具有致瘤性,基因敲除法不可取,所以本实验通过siRNA 的短期沉默即达到心肌细胞移植时抑制细胞凋亡的作用,同时又避免了肿瘤形成。

综上所述,PTEN 基因特异的siRNA 对心肌细胞的PTEN 基因有效的沉默能抑制大鼠心肌在耐受氧糖剥夺/复氧的环境中细胞凋亡,增强了细胞的存活能 力,为临床心肌梗死区域的心肌细胞存活提供新的治疗思路。