水产养殖废水脱氮除磷微藻的筛选

贾 纬，聂毅磊，陈 宏，罗立津，乐占线，庄 鸿，郑军荣

（福建省微生物研究所，福建 福州 350007）

0 引言

【研究意义】养殖废水富含氮、磷和有机物等，未经有效处理排放到周边水域，易破坏周边水域水环境的生态平衡，导致水体富营养化。养殖废水中的有机污染物主要包括碳水化合物、蛋白质和脂肪等，可生化性较好，能够适用于生物处理技术，而氮、磷等营养盐的溶出和积累构成了养殖废水中的无机污染物[1]。对于溶解性营养盐，目前多采用沉淀、过滤等物理或化学处理方法，但效果均不甚理想，而且成本高，易导致二次污染，而生物处理方法相对经济有效[2−3]。微藻是一类单细胞或简单多细胞的、以氮磷为主要营养源的光合自养型微生物，具有光能利用效率高、繁殖速度快、环境适应能力强和生长周期短等特性。微藻具有去除污水中有机污染物和氮、磷等无机污染物的功能[4−5]。与其他污水处理技术相比，微藻净化污水的主要优势：快速地去除使用传统处理工艺难以有效去除的氮、磷等污染物；在净化污水的同时可固定CO2，达到减排的效果[6]；收获的微藻可作为水产饵料和饲料添加剂，亦可作为原料应用于药品、食品和生物质燃料等高附加值产品的开发[7−9]。【前人研究进展】近年来，我国的海水养殖业发展迅速，养殖业的发展必然带来海水养殖废水的排放问题。由于海水养殖废水污染物组成复杂和盐度效应，增加了处理难度。目前有关微藻净化处理海水养殖废水的研究报道不多，尚没有成熟的处理技术能高效地去除海水养殖废水中的氮磷营养盐。丁一等[10]研究了固定化小球藻对海水养殖废水的处理效果，连续流运行15 d，固定化小球藻对海水养殖废水氨氮、磷酸盐的平均去除率分别为84.49%和72.17%；马航等[11]以青岛大扁藻为生物源的膜反应器，运行60 d，对海水养殖废水中TN和TP的去除率可达73.6%和77.9%；EIKassas[12]的研究表明，螺旋藻可以降低养殖系统中氨氮和硝酸盐氮的含量。马瑞阳等[13]研究了普通小球藻和芽孢杆菌共固定系统对海水养殖尾水的净化效果，结果表明其对NH4+-N、PO43－-P、Tp和COD的去除率分别为96.57%、98.62%、89.89%和39.09%.【本研究切入点】福建是水产养殖业大省，以海水养殖为主[14]，水产养殖业规模发展必然给废水处理带来挑战。本研究旨在筛选适宜福建海水养殖废水净化处理的藻种，为实际应用奠定基础。【拟解决的关键问题】本研究以前期筛选的小球藻JY-1、SY-4以及链带藻SH-1等3株微藻为对象，考察其在不同盐度f/2培养基和海水养殖废水中的生长状况，评价其盐度耐受性，同时研究3株微藻对海水养殖废水的脱氮除磷效果，以期筛选适合福建海水养殖废水净化处理的藻种，为福建养殖废水治理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

BG11固体培养基：NaNO31.5 g，K2HPO40.04 g，MgSO4·7H2O 0.075 g，CaCl2·2H2O 0.036 g，Na2CO30.02 g，柠檬酸0.006 g，Na2EDTA 0.001 g，微量元素溶液1 mL，蒸馏水1 000 mL，琼脂15 g；其中微量元素溶液含柠檬酸铁0.006 g·L−1、H3BO32.86 g·L−1、MnCl2·4H2O 1.81 g·L−1、ZnSO4·7H2O 0.22 g·L−1、Na2MoO4·2H2O 0.39 g·L−1、CuSO4·5H2O 0.08 g·L−1、CoCl2·6H2O 0.04 g·L−1，用NaOH或HCl调 节pH至7.1，121 ℃高压灭菌20 min。

f/2培养基：NaNO30.075 g，NaH2PO4·H2O 0.005 g，微量元素溶液1 mL，维生素溶液1 mL，蒸馏水1 000 mL，用NaOH或HCl调节pH到7.8，121 ℃高压灭菌20 min，维生素溶液用孔径0.22 μm的滤膜过滤除菌。其 中 微 量 元 素 溶 液 含CuSO4·5H2O 0.01 g·L−1、ZnSO4·7H2O 0.022 g·L−1、CoCl2·6H2O 0.01 g·L−1、MnCl2·4H2O 0.18 g·L−1、Na2MoO4·2H2O 0.006 g·L−1、Na2EDTA 4.36 g·L−1、FeCl3·6H2O 3.15 g·L−1，维生素溶液含维生素B1 100 mg·L−1、维生素B7 0.5 mg·L−1、维生素B12 0.5 mg·L−1。

养殖废水采集自福建长乐某南美白对虾养殖废水，初始指标为：盐度（7±1）‰，总氮（10.78±0.09）mg·L−1，氨态氮(2.75±0.02）mg·L−1，硝态氮（3.96±0.04） mg·L−1，亚硝态氮（0.10±0.005）mg·L−1，总磷 （0.85±0.03） mg·L−1。

1.2 藻种来源及培养条件

供试藻种为小球藻JY-1（Chlorella sp.JY-1）、小球藻SY-4（Chlorella sp.SY-4）以及链带藻SH-1（Desmodesmus sp. SH-1），均分离自长乐水产养殖废水。无菌条件下用接种环从BG11固体培养基斜面上挑取供试藻种接种于500 mL锥形瓶中，调整藻细胞含量至约105个·mL−1，培养基装量250 mL，置于光照培养箱中培养3～5 d。培养条件：温度25±1 ℃，光照强度4 000～5 000 lx，光照周期12∶12（L∶D），转 速150 r·min−1。

1.3 指标测定

采用显微计数法测定藻细胞含量。水质分析参照《水和废水监测分析方法》[15]，总氮采用过硫酸钾氧化紫外分光光度法（HJ636—2012），氨态氮采用纳氏试剂分光光度法（HJ535—2009），硝态氮采用紫外分光光度法（HJ/T346—2007），亚硝态氮采用紫外分光光度法（GB7493—87），总磷采用钼酸铵分光光度法（GB11893—89）。所用仪器为752型紫 外分光光度计（上海光谱仪器有限公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 微藻对不同盐度海水的耐受性分析 对福建长乐地区不同南美白对虾养殖池实地采样分析表明，养殖池水体盐度为5‰～17‰。据此配制f/2培养基，加入海盐使得盐度分别为5‰、10‰、20‰、30‰，考察3株微藻在其中的生长状况，筛选耐盐性高的微藻藻株。

无菌条件下用接种环从保藏斜面上挑取供试藻种，接种于不同盐浓度的f/2培养基中，调整藻细胞含量至约105个·mL−1。培养一周，用血球计数板在显微镜下观察，并计算出藻细胞数量。比较不同藻种 在各组培养基中的生长浓度。

1.4.2 微藻对养殖废水中氮磷去除效果的测定 取适量在f/2培养基中培养1周的微藻藻液，经3 000 r·min−1离心5 min，弃上清液，取藻细胞接种于装有250 mL养殖废水的500 mL锥形瓶中，调整藻细胞浓度至约105个·mL−1，同时以未添加藻细胞的养殖废水为空白对照，设立3个平行对照组，光照培养箱培养，培养条件：温度25±1 ℃，光照强度4 000-5 000 lx，光照周期12∶12（L∶D），转速150 r·min−1。分别于不同时间点取样，将水体用3 000 r·min−1离心5 min，取上 层水体测定氨氮、硝氮、亚硝氮和总磷等的含量。

1.4.3 氨氮去除率的计算方法 总氮、氨氮、硝氮、亚硝氮及总磷的去除率按以下公式计算

其中：P为去除率（%），C0和Cn分别为接种微藻前后养殖废水中总氮、氨氮、硝氮、亚硝氮和总 磷的质量浓度（mg·L−1）。

1.4.4 数据处理与分析 利用Microsoft Office Excel 2 019和SPSS19.0等软件对数据进行分析和图标制作。

2 结果与分析

2.1 微藻的盐度耐受性

3株供试藻种在不同盐度的f/2培养基中培养一周，对培养基中的藻细胞进行显微计数（图1），对不同藻种在不同盐度下的藻浓度显著性分析表明差异有统计学意义（P＜0.01）。3株藻均可以在盐度为5‰、10‰、20‰和30‰的f/2培养基中生长，其中小球藻JY-1、SY-4的细胞含量高于链带藻SH-1的 细胞含量。

2.2 微藻在水产养殖废水中的生长状况

对3株微藻在南美白对虾养殖废水中的生长浓度进行比较研究。经过5 d的培养，JY-1、SY-4和SH-1的细胞含量分别为1.56×107、1.47×107、6.62×106个·mL−1（图2）。表明3株微藻均能在盐含量为7‰±1‰的养殖废水中生长，其中小球藻JY-1的生长 能力相对较强。

2.3 微藻对养殖废水的脱氮除磷效果

由表1～表5可见，处理5 d，小球藻JY-1、SY-4和链带藻SH-1对南美白对虾养殖废水中总氮的去

图 1 3种微藻在不同盐度培养基中生长的最终细胞含量Fig. 1 Final cell densities of microalgae in media of varied salinities

图 2 3株微藻在水产养殖废水中的细胞含量曲线图Fig. 2 Growth of microalgae in aquaculture wastewater

除率分别为50.36%、41.51%和49.74%；氨态氮的去除率分别为96.29%、84.92%和96.65%；硝态氮的去除率分别为15.84%、3.69%和12.56%；总磷的去除率分别为93.51%、82.4%和94.1%；亚硝态氮的浓度有一定升高，推测可能是其他形态的氮转化成亚硝态氮导致其含量升高。添加微藻JY-1和SH-1的处理组中，随着微藻在养殖废水中的生长繁殖，藻细胞含量逐步升高，废水中的总氮、氨态氮和总磷水平逐步降低，至第3 d时相对较低，之后变化不明显，这与微藻在废水中的藻细胞含量变化曲线基本一致，说明微藻对废水中氨态氮和磷的同化作用随生物量增加而增长。而硝态氮、亚硝态氮在氨态氮快速下降的处理前期变化并不明显，推测微藻对氨态氮的降解可能是一个同化过程，而并非简单的物质形态变化[16]。氨态氮基本被利用，废水中的氨态氮降到一定水平后，硝态氮才开始被利用，但总体来说，微藻对养殖废水中硝态氮的去除效果并不显著。水体中的亚硝态氮早期变化不明显，而随着硝态氮的降解，亚硝态氮的降解才逐步提升。综合分析，小球 藻JY-1对水产养殖废水的脱氮除磷净化能力最强。

表 1 3株微藻对水产养殖废水中总氮的去除效果Table 1 Efficiency of total nitrogen removal by various microalgae （单位: mg·L−1）

表 2 3株微藻对水产养殖废水中氨氮的去除效果Table 2 Efficiency of NH 4+-N removal by various microalgae （单位: mg·L−1）

表 3 3株微藻对水产养殖废水中硝态氮的去除效果Table 3 Efficiency of NO3−-N removal by various microalgae （单位: mg·L−1）

表 4 3株微藻对水产养殖废水中亚硝态氮的去除效果Table 4 Efficiency of NO2−-N removal by various microalgae （单位: mg·L−1）

表 5 3株微藻对水产养殖废水中总磷的去除效果Table 5 Efficiency of total phosphate removal by various microalgae （单位: mg·L−1）

3 讨论与结论

污水成分复杂，同一藻株在不同来源污水中的生理活性有较大差异。即使是同一种属的不同藻株，其对污水的处理效果也大不相同[17−20]。因而，筛选适合本土养殖废水净化处理用藻种具有现实指导意义。本研究从长乐养殖废水中筛选获得3株盐度适应性较广、生长较好的微藻藻种，并利用其对半海水养殖的南美白对虾养殖废水进行氮磷污染物去除效果的研究，根据OD680nm数值评估微藻在污水中的生长状态。在实验环境下，SH-1和JY-1两株微藻对污水中的氮磷均具有较好的去除效果。培养3 d后，对氨氮的去除率在95%以上，对总磷的去除率在90%以上，链带藻SH-1更是以较低的生物量获得了与其他藻类相当的处理效果，显示了良好的应用前景。链带藻作为具有较强固碳能力的一种绿藻，可用于污水中氮磷污染物的去除[21]，但国内对链带藻用于养殖污水处理方面的研究鲜见报道，因此链带藻SH-1在养殖污水中的生理活性和生理机制值得深入研究。后续研究可以针对不同的底物水平，在处理条件和处理工艺方面进行进一步优化，探索该藻株对养殖污水净化处理的极限所在。

JY-1的去除效率略高于SH-1。值得注意的是，对硝氮的显著降解现象均仅出现在污水中的氨氮降低到一定水平后（本试验中是0.1～0.4 mg·L−1），另外在硝氮的降解过程中均伴随着亚硝氮水平的升高，水体中亚硝氮的积累可能对水产养殖造成一定影响，虽然在本研究中亚硝氮的最终水平并不高，但如果底物营养水平提高，处理时间延长，污水处理过程中产生的亚硝氮可能积累到一个更高的水平。如果要将本研究应用于养殖污水的原位处理，需要进一步摸索处理条件，引入具有互补和相互促进作用的其他种属藻类或反硝化菌群，进行藻-藻、藻-菌复合治理模式和处理工艺的探索[22−23]，这也是开展后续研究工作的一个可能的方向。由于微藻对废水中氮磷污染物的利用是一个同化过程，氮、磷等元素并未真正从水体中去除，而是富集成为藻类生物质的构成组分。因此，在废水净化处理过程中需及时利用过滤、离心等手段富集藻体进行加工再利用，或者直接将处理后富含微藻的养殖水体应用于水产动物的原位养殖，以免藻体衰亡后释放污染物造成水体环境的再次污染。