蜂糖李花粉离体萌发及活力保存研究

高 倩，黄 榜，张安平，李 悦，陈 红

(贵州大学 a贵州省果树工程技术研究中心，b科技学院，贵州 贵阳 550025)

蜂糖李为李树新良种，果实品质优良，受到众多消费者青睐，市场经济价值极高，现已发展成为具有贵州地域特色的优势产业，近年来在我国其他一些省份也具有了一定知名度。但关于蜂糖李的研究还处于初级阶段，许多生产上的难题还未解决，其中以坐果率低的问题最为突出。蜂糖李自花结实率低，花粉活力是否是造成坐果率低的原因，目前尚不明晰。生产上通过配置授粉树、人工辅助授粉和花期化控等措施[1-2]，使坐果率有一定程度的提高。蜂糖李还可作为杂交育种的优良种质资源，而较高的花粉活力是开展育种工作的基础，因为花粉活力直接关系到授粉受精过程。花粉活力除与自身质量有关外，也会受到外界条件的影响[3]。因此可通过人为筛选有利于花粉萌发和花粉管生长的环境条件，研究其影响机理，对提高授粉受精成功率具有重要意义，也可以为生产上的花期化控和杂交育种[4]提供理论参考。但李品种间的花期常常不一致，并且在自然状态下花粉寿命通常较短，这增加了杂交授粉的难度。开展花粉贮藏性研究，可克服花期不遇的问题，能为李的跨时间和跨地域杂交授粉提供有利条件。

目前，有关李花粉活力的研究很多[5-7]，但多集中在花粉活力测定、矿质营养和植物生长调节剂对花粉萌发率的影响及花粉贮藏期间温度对花粉活力的影响等方面。而将花粉管长度作为花粉活力评价指标，对影响花粉管长度因素的研究以及花粉贮藏过程湿度影响的研究较少，关于蜂糖李花粉活力的研究尚未见系统性的研究报道。基于此，本研究分析了蔗糖、H3BO3和植物生长调节剂(NAA、GA3和6-BA)对蜂糖李花粉萌发率和花粉管长度的影响，并探讨了贮藏方式对花粉活力的影响，筛选花粉离体萌发的最佳培养基组分和最适宜贮藏方式，以期为蜂糖李的杂交育种和花期化控研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料蜂糖李以及坐果率高的对照品种青脆李，均取自贵州省黔南州惠水县断杉镇大坡村蜂糖李栽培果园基地，基地面积200 hm2，海拔1 080 m，果园土壤为沙性土壤，pH 5.5～6.5；株行距3 m×4 m，树龄5年。2019年2月22日，在蜂糖李和青脆李进入大蕾期时，分别采集树冠外围中部东南西北各方位的一年生枝条带回实验室备用。

1.2 花粉采集和贮藏试验

摘取大蕾期的花朵，剥离出花药，置25 ℃恒温培养箱内散粉。待花粉散出后用孔径100 μm(150目)的标准检验筛过筛，分装在指形管内。在管内放置变色硅胶，将花粉分别置于4 ℃低温和-20 ℃冷冻条件下干燥贮藏。将蔗糖磨细后用孔径125 μm(120目)的标准检验筛过筛，与花粉按体积比5∶1的比例混匀，装至指形管2/3处，剩余1/3用过筛后的蔗糖填满作为蔗糖密封保存处理。于贮藏0，5，10，15，20 d取样，分析3种贮藏方式对花粉萌发的影响。

1.3 花粉活力试验

1.3.1 培养基筛选 培养基组分为琼脂(质量浓度均为10 g/L)、蔗糖、H3BO3，pH均为5.8，取-20 ℃保存的新鲜花粉进行试验。为研究不同质量浓度蔗糖和H3BO3对蜂糖李、青脆李花粉活力的影响，设计二因子四水平的全因子试验(表1)及单因素试验，以筛选蔗糖和H3BO3的最佳质量浓度。

表1 蔗糖和H3BO3对李花粉活力影响的全因子试验方案Table 1 Experimental design for effects of sucrose and H3BO3 on plum pollen activity g/L

1.3.2 植物生长调节剂对花粉活力的影响 筛选出最佳培养基组分后，在培养基pH为5.8、培养温度25 ℃、暗培养时间12 h的条件下，研究植物生长调节剂NAA、GA3、6-BA对2种李花粉(-20 ℃下保存材料)活力的影响，其中NAA质量浓度设为10，20，30，40 mg/L 4个梯度，GA3质量浓度设为20，30，50，80 mg/L 4个梯度，6-BA质量浓度设为5，10，15，20 mg/L 4个梯度。分别单独进行单因素试验，统计花粉萌发率并测定花粉管长度，筛选单个植物生长调节剂的最佳质量浓度。在研究某个植物生长调节剂时，同时以不加该调节剂作为对照,NAA、GA3、6-BA对照分别记为CK1、CK2和CK3。

1.3.3 花粉活力测定与分析 采用离体培养萌发法[8]，将配制好的培养基滴在双凹载玻片上，凝固后用发丝进行花粉的均匀播种，将玻片置于有湿润滤纸的培养皿中，25 ℃恒温培养箱暗培养12 h后，用OLYMPUS(BX63)显微镜于10倍镜下观察花粉萌发情况并测定花粉管长度，将花粉管长度大于花粉粒直径视为萌发[9],计算萌发率。每处理3次重复，每重复随机观察10个视野，每视野观察50个以上花粉粒，每重复测量15个花粉管长度。

1.4 数据处理

采用Excel 2010和SPSS 23.0进行数据的统计与分析，用Origin 2016绘图。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对蜂糖李花粉活力的影响

由表2可知，蜂糖李和青脆李的花粉萌发率及花粉管长度在蔗糖、H3BO3及二者交互作用下表现出极显著差异，说明蔗糖和H3BO3对其花粉活力有明显的影响。三者对蜂糖李花粉萌发率和花粉管长度的影响强度分别表现为：蔗糖>蔗糖×H3BO3>H3BO3,蔗糖>H3BO3>蔗糖×H3BO3，说明蔗糖对蜂糖李花粉萌发和花粉管伸长作用最大；三者对青脆李花粉萌发和花粉管长度的影响程度分别表现为：蔗糖>蔗糖×H3BO3>H3BO3，H3BO3>蔗糖×H3BO3>蔗糖，说明H3BO3对青脆李花粉管伸长作用更为明显。

表2 不同质量浓度蔗糖和H3BO3对2种李花粉活力影响的方差分析(主体间效应的检验)Table 2 Variance analysis of two plum pollen viability under different concentrations of sucrose and H3BO3(test of effect inter-subjectivity)

不同培养基对2种李花粉活力的影响见表3。由表3可知，蜂糖李花粉萌发率最高的培养基组分为100 g/L蔗糖+0.20 g/L H3BO3，萌发率可达61.47%；青脆李花粉萌发率最高的培养基组分为150 g/L+0.2 g/L H3BO3，萌发率为68.00%，与培养基为100 g/L蔗糖+0.20 g/L H3BO3的萌发率无显著差异，因此认为2种李花粉萌发的最适培养基为100 g/L蔗糖+0.20 g/L H3BO3。2种李花粉管伸长的最佳培养基组分均为150 g/L蔗糖+0.10 g/L H3BO3。由表3可知，2种李花粉萌发率随着蔗糖质量浓度升高而呈现先上升后下降趋势，说明过低或过高质量浓度蔗糖均不利于2种李花粉的萌发；花粉萌发率随H3BO3质量浓度上升总体呈V字形变化。花粉管长度随蔗糖质量浓度升高而变长，在蔗糖质量浓度为150 g/L时达到峰值，质量浓度继续上升花粉管变短；花粉管长度随H3BO3质量浓度升高逐渐变短，说明高质量浓度H3BO3会抑制花粉管的伸长。

由表3可见，在150 g/L蔗糖+0.10 g/L H3BO3培养基中，2种李花粉管均最长，且该培养条件下的花粉萌发率与最适花粉萌发培养基培养条件下的花粉萌发率无显著差异。综合考虑，最佳基本培养基组分为150 g/L蔗糖+0.10 g/L H3BO3，在此基础上进行后续单因素植物生长调节剂试验。

表3 不同培养基对蜂糖李和青脆李花粉萌发率及花粉管长度的影响Table 3 Effects of different media on germination and pollen tube length of Fengtang and Qingcui plum

2.2 植物生长调节剂对蜂糖李花粉活力的影响

由表4可知，随着NAA质量浓度的升高，蜂糖李的萌发率呈先增大后减小的趋势，在NAA质量浓度增至20 mg/L时，蜂糖李花粉萌发率最高，为74.03%，是对照的1.39倍。说明NAA对蜂糖李萌发的影响作用是双重的，超出适宜范围会表现出抑制作用，其最适NAA质量浓度为10～30 mg/L。对青脆李而言，其花粉萌发率则随NAA质量浓度的增大而逐渐降低。2种李花粉管长度均随着NAA质量浓度的升高而变短，说明NAA可以抑制花粉管的伸长，且质量浓度越高抑制作用越显著。花粉萌发过程中，与对照品种青脆李相比，蜂糖李能适应更大质量浓度范围的NAA。

表4显示，在本试验的质量浓度范围内，GA3均可以极显著地促进蜂糖李花粉的萌发。对青脆李而言，在GA3质量浓度为30 mg/L时可以极显著促进其花粉萌发。GA3质量浓度为20和50 mg/L时，蜂糖李花粉管长度极显著长于对照。总体而言，本试验GA3处理对青脆李花粉管长度无显著影响，但能同时促进蜂糖李花粉萌发和花粉管生长。

由表4还可知，6-BA质量浓度为5～10 mg/L时，蜂糖李萌发率均极显著高于对照，以5 mg/L时的萌发率最高，为69.68%，比对照提高了38.61%。6-BA质量浓度≥10 mg/L时，青脆李花粉萌发率均极显著低于对照。6-BA质量浓度达20 mg/L时，蜂糖李花粉管长度极显著低于对照，为397.67 μm，比对照降低了63.56%。总体而言，本试验所有6-BA质量浓度处理抑制了青脆李花粉萌发和花粉管的生长，而适宜质量浓度的6-BA能促进蜂糖李的花粉萌发。

表4 植物生长调节剂对蜂糖李和青脆李花粉萌发率及花粉管长度的影响Table 4 Effects of plant growth substances on germination and pollen tube length of two plum varieties

2.3 不同贮藏方式对蜂糖李花粉萌发率的影响

不同贮藏方式对蜂糖李、青脆李花粉萌发率的影响情况如图1所示。图1显示，不同贮藏条件下，随贮藏时间的延长，2种李的花粉萌发率均逐渐降低，但下降速度存在一定差异。4 ℃、-20 ℃和蔗糖密封保存条件下分别保存至5 d时，蜂糖李花粉萌发率分别降为23.76%，42.75%和43.92%，青脆李分别降为18.29%，38.92%和42.50%。其中均以蔗糖密封保存的花粉萌发率最高，4 ℃低温保存最低。说明花粉贮藏前期，萌发率表现出不稳定的状态，可能由环境骤变所导致。在贮藏的10～20 d，4 ℃低温保存和蔗糖密封保存的2种李花粉萌发率的下降幅度趋于平缓状态；而-20 ℃冷冻保存的花粉萌发率总体下降速度较快。至20 d时，4 ℃、-20 ℃干燥保存和蔗糖密封保存条件下，与新鲜花粉相比，蜂糖李花粉萌发率分别下降了62.88%，59.65%和21.72%；青脆李花粉萌发率分别下降了73.50%，59.77%和25.30%。也以蔗糖密封保存的花粉萌发率下降幅度最小，说明蔗糖密封保存可有效减小花粉活力的下降速度，延长贮藏时间。蔗糖密封保存到20 d时，蜂糖李花粉萌发率分别是4 ℃、-20 ℃处理的2.11和1.94倍；青脆李花粉萌发率分别是4 ℃、-20 ℃处理的2.82和1.86倍。说明蔗糖密封保存是最适宜的李花粉贮藏方式。且不同贮藏方式下，蜂糖李与对照品种青脆李贮藏期间花粉活力的变化趋势相似。

图1 不同贮藏方式下蜂糖李(A)和青脆李(B)花粉活力的变化Fig.1 Changes of Fengtang (A) and Qingcui (B) plum pollen germination rate under different storage methods

3 讨论与结论

适宜浓度的蔗糖和H3BO3对花粉萌发和花粉管生长具有明显促进作用，蔗糖作为营养物质，可在花粉萌发过程中提供能源，调节渗透压[10]。H3BO3能和蔗糖形成络合物，促进糖分吸收利用[11-12]，还能作为微量元素影响酶的活性，进而参与花粉管壁形成和改变管壁的延展性，促进花粉的萌发和花粉管的伸长[13-14]。本试验研究了蔗糖和H3BO3对蜂糖李与对照品种青脆李花粉活力的影响，结果发现蔗糖对花粉萌发和花粉管长度有较大影响。可能是因为蔗糖作为能源物质，在花粉萌发过程中起主导作用。本试验表明，促进蜂糖李花粉萌发和花粉管生长的最适培养基组分为150 g/L蔗糖+0.10 g/L H3BO3，在此培养基下，蜂糖李与对照品种青脆李花粉活力差异不大，说明花粉活力不是蜂糖李结实率低的主要原因。本研究发现，H3BO3质量浓度过高会抑制李花粉管的伸长，可能是其影响了花粉管伸长过程中花粉管壁的酯化果胶脱酯化[15]。孙慧瑛等[16]在杏上也得出相同结论，但与谢鹏等[17]、彭伟秀等[18]、薛晓敏等[19]的研究结论存在差异，这些研究中蔗糖和H3BO3的最适质量浓度各异。这可能与品种遗传特性、花粉营养状况、采集时间、培养条件或花粉活力测定方法等有关。

本研究表明，低质量浓度NAA(≤30 mg/L)、6-BA(≤15 mg/L)可以促进蜂糖李花粉萌发；所有NAA处理及10 mg/L以上的6-BA处理，均能显著抑制蜂糖李花粉管的生长。说明NAA和6-BA在适宜质量浓度范围内能明显提高蜂糖李花粉萌发率，但超出一定范围则表现出抑制作用，表现出“低促高抑”现象；而对花粉管生长而言，二者具有较明显的抑制作用。 周瑞金等[20]在杏梅上的研究也认为，低质量浓度6-BA能促进花粉萌发，超过一定范围则表现出抑制作用；而李学强等[7]在欧李上的研究则认为，低质量浓度NAA对花粉萌发和花粉管生长无明显促进作用；6-BA会抑制萌发，但适宜质量浓度可以促进花粉管伸长。这些研究成果说明，NAA、6-BA在不同植物上的影响效果存在较大差异。本试验中NAA和6-BA处理对青脆李的花粉萌发和花粉管伸长无促进作用，这与刘佳等[21]的研究结论相似。在本研究质量浓度范围内，GA3均可以显著促进蜂糖李花粉萌发，且其质量浓度为20，50 mg/L时对花粉管长度也有极显著促进作用，这与Sun等[22]在杏上的研究结论相似。需提出的是，本试验对GA3质量浓度设置存在欠缺，还应扩大浓度梯度范围，以筛选出抑制蜂糖李花粉萌发和花粉管伸长的GA3质量浓度。

只有较高萌发率和较长的花粉管才能保证植物最终的结实率，因此要综合考虑花粉萌发率和花粉管长度，才能更为准确地评价花粉活力。花粉萌发是植物授粉受精的前提条件，花粉管的长度最终决定受精过程能否顺利完成。以花粉管长度为重点观察指标，更能准确评价花粉活力的强度。因此，在最适花粉萌发和花粉管生长的培养基组分上，添加质量浓度20或50 mg/L的GA3配成营养液，在蜂糖李花期进行喷施，可能可以提高蜂糖李的授粉受精成功率。但这是实验室得出的结论，具体效果还得进行田间试验，且喷施次数和间隔时间、营养液的pH等田间试验影响因素也应加以考虑。

花粉贮藏过程中依然在进行微弱的代谢生理活动，不断消耗花粉内的原有营养物质，进而导致花粉萌发率不断下降[23]。花粉活力下降速度与贮藏条件有密切关系，其中贮藏温度是影响花粉寿命的重要因素。许多研究表明，降低贮藏温度可有效延长花粉的寿命[24]。本研究也表明，冷冻保存较低温保存更能延长花粉寿命，可能是更低的温度降低了花粉的呼吸强度，导致代谢速度缓慢，减少了糖类、矿质营养和有机酸等的消耗，从而延长了花粉寿命。对大多数植物花粉来说，湿度也是影响花粉活力的重要因素[25-27]，本试验采用蔗糖密封保存研究了花粉贮藏过程中环境湿度的影响，结果表明蔗糖密封保存能有效提高贮藏过程中的花粉活力。花粉萌发过程中蔗糖作为能量源，能补充花粉贮藏过程可溶性糖类物质的消耗，同时使花粉贮藏的环境湿度维持在一个稳定合适的状态。综合分析，李花粉的保存以蔗糖密封保存效果最为理想，这不但能有效降低花粉萌发率的下降速度，延长贮藏时间,而且因可常温保存，在异地杂交时携带方便，田间操作性和灵活性更强。但关于蔗糖维持贮藏环境相对湿度的适宜范围，以及其是否补充了花粉贮藏过程中糖类物质的消耗等，均有待进一步研究。