神经外科耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌肺部感染的危险因素分析

林秀娟，朱健强，周勇

(1.广州医科大学附属第二医院医院感染管理科，广东 广州 510260；2.广州市疾病预防控制中心，广东 广州 510440)

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，Pa)是假单胞菌属的代表菌种，因在琼脂平板上能产生蓝绿色绿脓素，感染伤口时形成绿色脓液，亦称绿脓杆菌。Pa在自然界广泛分布，是医院内感染最常见的革兰阴性条件致病菌之一，也是医院获得性肺炎的主要病因[1]。神经外科病房是发生Pa相关医院内感染的高危科室，该科收治的大部分患者术前或术后常处于昏迷状态，机体抵抗力差、合并症多，并且频繁接受创伤性诊疗操作，这些均是Pa医院内感染的危险因素[2]。碳青霉烯类抗生素是治疗Pa感染的常用药物，近年来耐碳青霉烯类Pa(carbapenem resistant Pa，CRPa)临床分离率逐年增加[3]。因此，了解神经外科Pa肺部感染患者的药敏、流行情况及危险因素等，对准确选择抗生素预防和治疗Pa感染具有重要的临床意义。本研究前瞻性调查神经外科CRPa的流行状况，为临床预防和诊治Pa感染提供依据，报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

采用前瞻性研究方法，调查神经外科Pa感染情况。本研究纳入2017年11月至2019年8月广州医科大学附属第二医院神经外科收治的住院患者6 197例，包括神经外科一、二、三区和神经外科重症监护室(NICU)。收集患者年龄、性别、发病原因、基础疾病、住院时间，并前瞻性收集侵袭性操作、抗生素使用情况等。

1.2 Pa肺炎的诊断

Pa肺炎的诊断标准：(1)肺部影像学诊断为肺炎；(2)痰或呼吸道分泌物检查提示Pa感染；(3)存在发热或咳嗽等呼吸道感染表现。满足上述条件者可诊断为Pa肺炎。

患者出现咳嗽、咳痰、发热、呼吸急促或呼吸困难时，采用口腔咳痰、吸引器吸痰或支气管镜检吸痰送检行细菌培养，同时给予床边胸片或肺部CT检查明确肺部出现感染病灶。按照《全国临床检验操作规程》对送检痰样本进行接种和培养，使用Microflex LT质谱仪(德国Bruker Daltonics)和VITEK2全自动微生物鉴定仪(法国梅里埃)进行Pa鉴定。

1.3 药敏试验

采用VITEK2全自动微生物鉴定仪检测细菌对包括亚胺培南在内的抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)，药敏结果解释参照美国CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)标准，亚胺培南的MIC≥8 μg/mL表示铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药。质量控制标准菌株为大肠杆菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853。

1.4 常见金属β-内酰胺酶基因检测

参照文献[4-5]采用逆转录PCR(RT-PCR)扩增常见金属β-内酰胺酶基因VIM、IMP、NDM、KPC等。PCR引物序列见表1。扩增产物行琼脂糖凝胶电泳并进行鉴定。

表1 常见金属β-内酰胺酶基因PCR扩增引物

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 神经外科住院患者Pa肺部感染情况

共纳入患者6197例，诊断医院内Pa肺部感染61例(0.98%)，其中CRPa肺部感染50例(82.0%，50/61)、碳青霉烯类敏感的铜绿假单胞菌(CSPa)肺部感染11例(18.0%，11/61)。CRPa肺部感染患者年龄为(58.3±12.9)岁，其中女18例、男32例；主要病因为脑血管意外42例(84.0%，42/50)，最常见合并症为糖尿病(32.0%，16/50)。诊断为Pa肺部感染的患者，先采用经验性用药，以哌拉西林/三唑巴坦联合喹诺酮类抗生素为主，随后根据药敏结果选择敏感抗生素进行治疗，抗生素治疗时间为(13.7±6.8)d。CSPa肺部感染患者年龄为(52.4±9.1)岁，其中女4例、男7例；抗生素治疗时间为(10.3±5.7)d。

2.2 神经外科住院患者Pa肺部感染耐药分析

药敏试验显示，Pa对庆大霉素和阿米卡星的敏感率较高(75.4%、93.4%)；其次对部分青霉素类如哌拉西林/他唑巴坦的敏感率为31.1%，第四代头孢类抗生素如头孢吡肟仅为18.0%，而对第一代、二代和三代头孢类抗生素均几乎耐药；对亚胺培南的耐药率也高达82.0%。见表2。PCR共检出11株Pa携带金属β-内酰胺酶(18.0%，11/61)，包括VIM-2基因阳性7株、IMP-9基因阳性4株，基因检测电泳图见图1，图2。CSPa均未发现携带金属β-内酰胺酶。

表2 神经外科住院患者Pa肺部感染61例的药敏试验结果 [n(%)]

2.3 CRPa肺部感染的危险因素分析

单因素分析显示，患者年龄>60岁、住院时间>2周、抗生素使用时间>2周、入住NICU、使用呼吸机、伴有昏迷或脑血管意外等均是CRPa肺部感染的危险因素(均P<0.05)，见表3。

注：M：分子量标准；N：阴性对照；P：阳性对照；1：阴性菌株；2～8：阳性菌株

注：M：分子量标准；N：阴性对照；P：阳性对照；1～3：阳性菌株

表3 耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌肺部感染的危险因素分析(例)

3 讨 论

Pa是导致住院患者肺部、血流、尿路和外科手术部位感染最常见的致病菌。美国疾病预防和控制中心(CDC)2017年的调查显示，全国住院患者中发生多重耐药Pa感染32 600例，其中死亡2 700例(8.3%)，2%～3%的多重耐药Pa为耐碳青霉烯类Pa。Pa是美国ICU分离最常见的需氧革兰氏阴性菌、呼吸道定植最常见的条件致病菌，也是呼吸机相关肺炎最常见的致病菌[6]。本研究显示，神经外科Pa感染性肺炎的发生率为0.98%，由于Pa肺炎有极高的死亡率，因此需对此类院内感染给予高度重视。

袁莉莉等[7]研究显示，医院内Pa感染主要分布在神经外科(31.7%)、ICU(20.2%)和老年科(17.3%)。Labaste 等[8]报道，Pa感染的主要危险因素为高龄、合并糖尿病或慢性阻塞性肺疾病、气管插管或使用呼吸机、长时间使用抗生素等，而未根据药敏结果选用亚胺培南等广谱抗生素进行抗感染治疗或预防性治疗是造成医院发生CRPa和多重耐药Pa的重要原因。神经外科是患者发生昏迷、使用呼吸机和外科侵袭性操作的主要科室，也是院内感染发生的主要科室。本研究通过前瞻性的数据收集和分析，发现神经外科Pa肺炎的主要危险因素是入住NICU、使用呼吸机、使用抗生素时间>2周。Luyt等[9]研究显示，Pa是呼吸机相关肺炎的主要病原菌，与神经外科昏迷患者常需收入NICU且大部分患者需要长时间呼吸机辅助治疗有关。Pa在机体主要定植在呼吸道，极易在气管插管表面形成生物膜，如不合理使用抗生素可迅速诱导多重耐药发生[10]。社区获得性肺炎罕见由Pa感染所致，除非机体合并存在免疫缺陷或肺部囊性疾病，说明患者免疫力低下是Pa肺炎发生的重要原因[11]。因此，需要加强神经外科的抗生素合理使用、规范侵袭性操作和提高患者自身免疫力。

2009年国内28家医院调查显示，Pa对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为37.5%和28.0%，金属β-内酰胺酶(MBL)的阳性率为8.73%[12]。本研究中Pa肺炎患者分离标本药敏试验提示Pa对头孢类抗生素均几乎耐药，对亚胺培南的耐药率高达82.0%，其中MBL阳性率为18.0%，表明当前医院内CRPa上升的主要原因可能是MBL阳性率增加所致。最近研究也显示CRPa携带如VIM-2和IMP-9等MBL的发生率高达16.36%～32.8%[13]。2000年发现社区感染来源的大肠杆菌已具备产生超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的能力，几乎可以水解除碳青霉烯类抗生素以外的各种β-内酰胺类抗生素，全球范围内开始大量使用碳青霉烯类抗生素，随后不久发现了能水解碳青霉烯类抗生素的β-内酰胺酶，也称为碳青霉烯酶[14]。碳青霉烯酶主要归类于β-内酰胺酶分类的A(KPC-1，KPC-2)、B(IMP，VIM)和D(NDM-A，NDM-B)类。A和D类主要具有丝氨酸酶活性，可被克拉维酸、舒巴坦或他唑巴坦等抑制；B类不能被上述丝氨酸酶类抑制剂所抑制，但可被金属螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)等抑制。碳青霉烯酶的主要类型是MBL的IMP和VIM，本研究显示Pa肺炎的主要类型是VIM-2和IMP-9，未发现KPC和NDM类碳青霉烯酶。VIM-2和IMP-9可以水解绝大部分的β-内酰胺，主要通过转座子、质粒和其他基因移动元件在不同种类的细菌之间进行传播。李飞等[15]进行CRPa同源性分析，显示住院患者的Pa定植和不同种类细菌MBL基因传递是导致Pa感染的主要原因之一，因此控制CRPa在不同医院和不同菌种之间的传播同样显得十分重要。

既往的院内感染调查主要通过回顾性分析医院内感染发生和治疗过程，这已不能满足现代医院内感染的防控需要。通过对神经外科病房Pa感染的前瞻性调查分析，可及时掌握病区内主要Pa流行株的耐药基因、耐药表型和克隆演化，一旦医院内感染发生，可为临床第一时间选择有效抗菌药物提供依据；另一方面，通过遏制多重耐药Pa菌珠可以预防Pa医院内感染的暴发。