辣椒炭疽菌干热处理技术研究

程唤奇，骆清兰，郑小玲，杨玲丽，孙 丹，刁永朝，胡茂林

（1.深圳市农业科技促进中心，广东 深圳 518055；2.深圳市植物保护与土壤肥料行业协会，广东 深圳 518055；3.中国农业大学植物保护学院，北京 100193）

【研究意义】辣椒引入我国至今已有400多年的历史，现已成为我国栽培面积第二、经济效益第一的蔬菜作物，是我国蔬菜的核心产业之一［1］。辣椒炭疽病是辣椒上一种普遍发生的真菌性病害，其病原菌种类较多，属于类别复杂、种类繁多的子囊菌门炭疽菌属（Colletotrichumsp.）。辣椒炭疽病主要为害辣椒果实和叶片，也可侵染茎部，通常其病果率在10%左右，严重时可高达30%～40%［2］，严重影响产量和效益。【前人研究进展】不同地区辣椒炭疽病的主要病原菌有所不同，其中分布较为普遍的是平头炭疽菌（Colletotrichum truncatum）和尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）［3-4］。这两种炭疽菌对辣椒果实均具有很强的致病性。由C.acutatum引起的辣椒炭疽病是近年来出现的新病原物，具有很强的寄主专化性，能够危害辣椒、草莓、芒果等果实，相比于C.truncatum，其具有更强的致病性与药剂耐受力［5-8］。辣椒炭疽菌可进行种子传播，通常以分生孢子形态附着于种子表面或菌丝体潜伏在种子内越冬［9］。辣椒种子作为炭疽菌初侵染源之一，如何从种子源头遏制该病菌的侵染尤为重要。目前针对辣椒炭疽病的防治方法主要以化学防治为主，但是化学药剂的过度使用易产生抗药性，造成环境污染，破坏生态平衡［10］。【本研究切入点】已有的种子热处理相关研究表明，通过种子干热处理，可有效抑制病害的发生，同时有助于种子解除休眠，提高种子发芽势和发芽率［11］。播种前采用非化学防治技术对辣椒种子进行热处理可以大规模、安全、有效地防治种传真菌性病害的发生［12］。相比于化学药剂处理，通过对辣椒种子进行干热处理可以减少辣椒炭疽病对植株和果实的危害，且更加安全无污染，减轻对自然环境带来的不良影响。【拟解决的关键问题】当前，国内外关于辣椒种子携带炭疽菌热处理技术研究鲜有报道。基于此，本研究围绕辣椒炭疽菌的主要优势种平头炭疽菌（C.truncatum）和尖孢炭疽菌（C.acutatum）在离体条件下进行热处理，同时结合带菌种子干热处理效果，综合评价热处理后病原菌的生长速率、孢子萌发抑制率、辣椒种子发芽势和发芽率等指标，探究辣椒种子携带炭疽菌的干热处理方法，从而为蔬菜种子带菌干热处理（尤其是炭疽菌的处理）提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 平头炭疽菌Ct wc 57 菌株和尖孢炭疽菌H-2 菌株均由深圳市农业科技促进中心植检种子健康实验室分离获得。

1.1.2 供试种子 永优219 辣椒种子由深圳市农业科技促进中心于2019 年11 月从种子经营门店抽样获取，种子含水量为5.02%。

1.1.3 培养基 水琼脂培养基（Water Agar，WA）：琼脂粉14 g，加蒸馏水定容至1 000 mL，121 ℃、21 min 高压灭菌后备用；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖18 g，琼脂粉14 g，加蒸馏水定容至1 000 mL，121 ℃、21 min 高压灭菌后备用。

1.1.4 仪器设备 WHTM-225A 恒温恒湿箱、ZQTY-70F 恒温摇床、ZEIWAT GR60DF 全自动高压灭菌锅、海博特FH-1 200 探入式植物培养箱、ZEISS AXIO 生物显微镜、徕卡DM i8 倒置显微镜、奥豪斯MB120 水分测定仪、种子发芽盒、20 mL玻璃试管。

1.2 试验方法

1.2.1 炭疽菌菌丝干热处理 分别设置温度50、52、55、60 ℃及处理时间1、2、4、8 h，共16个处理，以不做任何处理为空白对照。

将在PDA 培养基中28 ℃恒温黑暗培养3 d的平头炭疽菌Ct wc 57、尖孢炭疽菌H-2 分别进行上述干热处理，每个处理3 次重复，每个重复处理后转板培养4 皿，沿热处理后的病菌菌落边缘挑取直径3 mm 的菌丝块置于PDA 平板培养基中，并在28 ℃恒温黑暗条件下倒置培养7 d，测量并记录菌丝体的生长直径［13］。

1.2.2 炭疽菌孢子干热处理 设置温度为50 ℃，时间分别为10 min、20 min、30 min、40 min、1 h、2 h，共6 个处理，以不做任何处理的孢子为空白对照。

炭疽菌液体培养5 d 后，分别收集平头炭疽菌Ct wc 57 和尖孢炭疽菌H-2 孢子悬浮液，将浓度统一调节至孢子含量为1.66×106CFU/mL；用移液枪吸取5 mL 混合均匀的孢子悬浮液于无菌试管后置于恒温恒湿箱内按上述条件进行干热处理，每个处理3 次重复。经干热处理后取出置于室温，在超净工作台中分别吸取100 μL 孢子悬浮液于WA 平板培养基中涂板。

将接种有炭疽菌孢子的WA 平板培养基置于28 ℃培养箱中倒置培养1 d 后用徕卡DM i8 倒置显微镜观察孢子萌发。每个处理3 次重复，每个重复观察10 个视野，每个视野内孢子数量不少于20 个孢子，即每个处理随机调查统计不少于600个孢子的孢子萌发数量。

1.2.3 辣椒种子干热处理 设置温度55 ℃处理1、2、4、8 h，60 ℃处理1、2、4、8、16、24 h，66 ℃处理8、16、24 h，68 ℃处理8、16、24 h，共16 个处理，以不做任何处理为空白对照；每个处理随机挑取辣椒种子400 粒，设置4 个重复，每个重复100 粒，将随机挑取的辣椒种子置于恒温恒湿箱中进行辣椒种子干热处理。

将干热处理之后的13 批辣椒种子及未做任何处理的对照种子根据GB/T 3543.4《农作物种子检验规程发芽试验》（1995）［13］进行发芽试验。具体操作方法：将种子均匀摆放于铺有2 层湿润发芽纸的19 cm×13 cm×8 cm 发芽盒中，100 粒/盒，并置于探入式植物培养箱内28 ℃、70% RH条件下黑暗培养至种子露白后12 h 黑暗/光照交替培养，于生长期7、14 d 分别调查统计种子发芽势与发芽率。

孢子萌发抑制率（%）=（对照孢子萌发数-热处理孢子萌发数）/对照孢子萌发数×100

发芽势（%）=第7 d 正常发芽种子数/供试种子数×100

发芽率（%）=第14 d 正常发芽种子数/供试种子数×100

试验数据使用Excel 2003 进行极差分析整理，采用DPS 数据处理系统进行差异显著性分析，采用Graph Pad Prism 5 数据处理软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 干热处理对辣椒炭疽菌菌丝体的影响

通过对平头炭疽菌和尖孢炭疽菌菌丝体进行不同干热处理，发现培养7 d 后的菌落直径存在差异（图1、图2），菌落直径随着干热处理温度的增加及时间的延长而减小。其中，平头炭疽菌50 ℃处理2 h 及52、55、60 ℃处理1 h 后病原菌处于失活状态（图1、图2）；尖孢炭疽菌50 ℃处理4 h、52 ℃处理2 h 和4 h 及55 ℃和60 ℃处理1 h 后病原菌处于失活状态（图1、图3）。

图1 不同干热处理平头炭疽菌和尖孢炭疽菌的生长速率Fig.1 Growth rate of Colletotrichum truncatum and Colletotrichum acutatum under different dry heat treatments

图2 不同干热处理平头炭疽菌菌落生长形态Fig.2 Morphological characteristics of Colletotrichum truncatum colony under different dry heat treatments

图3 不同干热处理尖孢炭疽菌菌落生长形态Fig.3 Morphological characteristics of Colletotrichum acutatum colony under different dry heat treatments

2.2 干热处理对辣椒炭疽菌孢子萌发的影响

平头炭疽菌和尖孢炭疽菌孢子悬浮液分别进行不同干热处理，经固体培养1 d 后孢子萌发率差异显著。两种病原菌孢子萌发抑制率分别随着干热处理时间的延长而逐渐增高。平头炭疽和尖孢炭疽孢子经50 ℃处理20 min 后均无萌发，抑制率均达到100.00%（图4）。本试验中，孢子萌发的标准是芽管长度达到分生孢子短径长度1倍的记录为萌发［14-15］（图5）。

图4 50℃干热处理炭疽病菌的孢子萌发抑制率Fig.4 Inhibition rates of spore germination of Colletotrichum after dry heat treatment at 50℃

图5 炭疽菌孢子萌发特征Fig.5 Characteristics of Colletotrichum spores germination

综合2.1 和2.2 干热处理结果可以得出，C.truncatum和C.acutatum在55℃、1 h 干热处理后菌丝及孢子体生长与萌发完全受到抑制，为最佳的干热处理条件。

2.3 干热处理辣椒种子活力测定

对辣椒种子永优219 进行不同干热处理后的发芽势及发芽率进行测定，结果（表1）表明：在55～66 ℃、1～24 h 处理区间内发芽势和发芽率与CK 相比差异不显著；在68 ℃处理8、16、24 h 后发芽势和发芽率与CK 相比差异显著，经16 h 和24 h 处理后辣椒种子萌发完全受到抑制。

表1 干热处理辣椒种子的发芽势与发芽率Table 1 Germination potential and germination rate of pepper seeds after dry heat treatment

以上结果表明，在温度55～66 ℃、1～24 h 处理区间内即可完全抑制C.truncatum和C.acutatum离体菌株生长，且不影响辣椒种子正常出苗。

3 讨论

真菌性种传病害是由于种子表面或者种子内部携带相应的病原真菌所引起，种子带菌通常可以作为植物病害传播的初侵染源造成作物大面积发病，从而严重影响经济收益［13］。辣椒种子携带的不同种类炭疽病菌对干热处理的温度和时间敏感程度略有差异，在50 ℃下，C.truncatum和C.acutatum离体菌株分别处理2 h 和4 h，菌丝和孢子体抑制率达100%，在55 ℃处理1 h 后菌丝和孢子体生长抑制率均达到100%；田间耕作需要大批量制种时，为了节省时间成本，选取55 ℃、1 h 进行干热处理较为适宜。

种子干热处理作为一种安全有效的种子处理技术在生产上应得到广泛的推广和应用，干热处理后的辣椒种子可以增强种皮的通透性，提高发芽速度，有利于培育壮苗［16］。但应注意的是，种子干热处理要在其安全范围内进行，过高的温度或者过长的时间都会对种子活力产生影响［17-18］。针对永优219 辣椒种子进行不同条件干热处理后发现，在55～66 ℃、1～24 h 处理区间内可有效提高辣椒种子发芽势和发芽率。有研究表明，辣椒种子在40、50、60、70、80 ℃烘干8 h后直接置床可明显提高种子发芽势，对发芽率无影响；烘干后浸种8 h 再置床处理明显影响发芽率［19］。这与本研究处理的温度和时间差距较大，本研究干热处理时间和范围灵活度较高，对辣椒种子活力无影响，更可有效提高其发芽势和发芽率，因此更有利于应用到生产实践中。Jiyum 等也结合生物防治和温汤浸种的方法对种传病害进行处理，得到的处理结果与单独进行干热处理的效果相差不大［20-21］。

本研究主要针对C.truncatum和C.acutatum两种离体炭疽菌和健康辣椒种子进行不同条件的热处理，以筛选出适用于可抑制菌株生长和促进种子萌发的干热处理条件，为携带炭疽菌的辣椒种子干热处理提供参考依据，该处理技术在辣椒种植过程中的田间应用效果还有待进一步验证。

4 结论

本研究基于辣椒炭疽菌优势种平头炭疽菌和尖孢炭疽菌及健康辣椒种子干热处理条件进行试验，同时对比分析了在不同热处理条件下菌丝及孢子体生长状况和种子芽势、芽率生长状况。试验结果表明，在温度55～66 ℃、时间1～24 h 干热组合处理区间可为蔬菜种子带菌干热处理提供参考依据。