荧光硅量子点在现代分析技术实验教学中的应用

林碧霞

（华南师范大学化学学院广州市生物医药分析化学重点实验室，广州 510006）

0 引言

现代分析技术实验是一门综合性、应用性强，且广泛融合现代科学技术的实验。在很多高校的化学、环境、材料、能源、生物等专业中均开设现代分析技术实验，包括光谱分析、色谱分析、质谱分析、能谱分析、电分析、热分析、显微分析等分析技术。荧光光谱法是现代光谱分析技术之一。现行的荧光光谱实验中，主要是通过荧光光谱对维生素B2进行定量分析。该实验项目为传统的验证性项目，主要让学生掌握基本的荧光光谱原理和荧光光度计的使用方法，实验内容简单，需要学生思考和探索的余地较少［1］，更没有涉及更深一步的荧光传感机理和目前研究前沿的荧光纳米材料。

荧光纳米材料由于具有良好的光学性质、水溶性好、生物兼容性好、可功能化等优点，被广泛应用在传感检测、生物成像、医学诊疗等方面［2-4］。硅量子点是近些年出现的一种新型荧光纳米材料，其合成方法简单快速，可通过一步水热法或者微波反应法便可得到水溶性良好的硅量子点，且其荧光量子产率高、抗光漂白性强、稳定性好［5-7］。维生素B12是一种重要的维生素，与人体的多种生命活动息息相关，人体缺乏维生素B12会产生贫血、心血管疾病及神经损伤［8］。人体缺乏维生素B12时多通过服用维生素B12药片来补充。对于维生素B12的检测，荧光光谱法已成为主要检测方法之一［9-10］。

目前，为了培养创新型人才，越来越多的高校将成熟的科研成果引入到实验教学与人才培养中［11-12］，进行科研与实验教学相结合［13］。同时，通过采取不同层次并行的策略，在加强学生掌握基础知识的前提下，对于学有余力的学生力求多拓展学生的视野、加强科研能力的培养，加强创新思维的训练，从而提高学生的综合能力。因此，为了达到该教学目的，将科研上的荧光纳米材料硅量子点引入到荧光光谱法实验中，设计了现代分析技术新创实验“基于硅量子点的荧光光谱法测定维生素B12的含量”。其原理是利用维生素B12对硅量子点具有内滤效应，能够灵敏猝灭硅量子点的荧光，从而建立猝灭型荧光光谱法对维生素B12进行定量分析。该实验将科学研究中的热点材料引入到实验教学中，不仅可以加深学生对仪器工作原理的理解，提高相关仪器的操作技能和动手能力，同时能够引导学生了解科学发展动态，培养学生的科研兴趣［14-15］。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

丙三醇、二水柠檬酸三钠、无水乙醇购于天津市致远化学试剂有限公司。3-氨丙基三乙氧基硅烷和维生素B12购于阿拉丁试剂公司。实验所用水均为二次蒸馏水。荧光光谱用F-4600 型荧光光谱仪（日本日立）测定。微波反应采用XO系列超声波微波组合反应器（南京先欧仪器制造有限公司）。

1.2 硅量子点的合成

取10 mL 丙三醇溶液于三口烧瓶中，通入氮气5 min，除去溶液中的氧气。加入0.316 8 g 的二水柠檬酸三钠，搅拌均匀。再逐滴加入2.0 mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，继续搅拌得到透明的前驱体溶液。将前驱体溶液转移至微波反应器中，在微波功率为400 W、微波温度为180 ℃的条件下反应10 min，得到暗棕色的溶液。往反应后的溶液中按体积比为1∶25 的比例加入无水乙醇，并在6 000 r/min 下离心20 min，保留上清液为硅量子点溶液。

1.3 维生素B12的检测条件优化

取7 个干净的5 mL容量瓶，分别加入0.50 mL 硅量子点溶液，2.00 mL pH 为5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0 的缓冲溶液（10 mmol），2.00 mL 浓度为50 μmol的维生素B12标准溶液，摇匀，并用二次水定容至5.00 mL后，在室温下反应3 min。随后在激发和发射狭缝为10 nm、激发波长为360 nm的条件下测定各溶液在发射波长为460 nm的荧光强度。

在5 mL的容量瓶中，加入0.50 mL 硅量子点溶液，2.00 mL 磷酸缓冲溶液（10 mmol，pH 7.5）和2.00 mL浓度为50 μmol 的维生素B12标准溶液，摇匀，并用二次水定容至5.00 mL。每隔3 min 测定一次460 nm的荧光强度。

1.4 维生素B12的标准曲线

取7 个干净的5 mL容量瓶，分别加入0.50 mL 硅量子点溶液，2.00 mL 磷酸缓冲溶液（10 mmol，pH 7.5），0、0.05、0.10、0.50、1.00、1.50、2.00 mL浓度为50 μmol的维生素B12标准溶液，摇匀，并用二次水定容至5.00 mL后，在室温下反应3 min。随后在激发和发射狭缝为10 nm，激发波长为360 nm的条件下测定系列溶液在发射波长为460 nm的荧光强度。以维生素B12的浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标，绘制检测维生素B12的标准曲线。

1.5 维生素B12药片的检测

取市售维生素B12药片，用研钵研成粉末，加水溶解后过0.22 μm的滤膜，滤液转移到10 mL的容量瓶并用二次水定容至刻度，得到维生素B12药片的样品溶液。取另一个干净的5 mL 容量瓶依次加入0.50 mL硅量子点溶液，2.00 mL 磷酸缓冲溶液（10 mmol，pH 7.5），1.00 mL的维生素B12样品溶液，用二次水定容至5.00 mL后，室温下反应3 min。随后测定460 nm的荧光强度，并通过标准曲线计算样品中维生素B12的含量，用μg/片表示。

2 结果与分析

2.1 硅量子点荧光光谱曲线的测定

首先对合成的硅量子点进行光谱分析，寻找最佳的激发和发射波长。如图1 所示，固定发射波长为460 nm，扫描325～400 nm范围内的激发强度，得到硅量子点的最佳激发波长为360 nm。反过来，固定用360 nm波长的光激发硅量子点，扫描400～550 nm范围内的发射强度，得到硅量子点的最佳发射波长在460 nm。合成的硅量子点具有较强的荧光强度，与维生素B12的紫外吸收（362 nm）有重叠，适合后续利用内滤效应的荧光猝灭机理定量检测维生素B12。

图1 硅量子点的荧光光谱曲线

2.2 维生素B12的检测条件探究

为了获得硅量子点对维生素B12的最佳响应效果，需要对硅量子点检测维生素B12的实验条件进行探究。首先对硅量子点测定维生素B12时的pH值进行探究。如图2 所示，随着pH 从5 逐渐增加到9，测得的荧光强度基本变化不大。当pH 为7.5 时，测得的荧光强度最小，此时维生素B12对硅量子点荧光的猝灭最大，因此选择pH 为7.5 作为测定硅量子点检测维生素B12的最佳pH。

图2 pH值对荧光强度的影响

反应时间也会影响检测的效果，于是对硅量子点检测维生素B12时的反应时间进行探究。如图3 所示，当体系中加入维生素B12反应3 min时，硅量子点的荧光强度已明显下降。3 min 后荧光强度基本不变。因此选择3 min作为硅量子点检测维生素B12的最佳反应时间。

图3 反应时间对荧光强度的影响

2.3 维生素B12的标准曲线

通过上述探究，得到硅量子点检测维生素B12最佳的pH是7.5，最佳反应时间是3 min。在该测定条件下，测定硅量子点中加入浓度分别为0、0.5、1、5、10、15、20 μmol时，维生素B12的荧光强度分别为1 457、1 384、1 373、1 238、1 049、801、599。

利用该数据绘制标准曲线，如图4 所示，随着维生素B12浓度逐渐增大，硅量子点的荧光强度逐渐减弱，这是因为维生素B12对硅量子点具有内滤效应，能够灵敏猝灭硅量子点的荧光。当维生素B12浓度在0.5～20 μmol范围内时，硅量子点的荧光强度与维生素B12的浓度呈良好的线性关系，线性回归方程F=-41.32C+1 433（C：μmol），相关系数为R2=0.995 4。

图4 硅量子点测定维生素B12的标准曲线

2.4 维生素B12药片的检测

按照前述的实验操作步骤制备维生素B12药片的样品溶液并进行荧光光谱测定，测得的荧光强度代入上述检测维生素B12的标准曲线中，计算得到维生素B12药片中维生素B12的含量为978 μg/片，与标示的含量（1 000 μg/片）接近，说明该方法准确可靠，可用于实际样品的检测。

3 结语

该实验选择了与人们健康息息相关的维生素B12作为检测对象，并选择了典型的荧光纳米材料硅量子点作为检测手段，检测原理简单易懂又具有代表性，实验结果重复性好，适用于实验教学中。此外，将该实验作为现代分析技术实验的一个新创实验，通过该实验能训练学生的科研思路和创新意识［16-17］。在进行该实验教学时要注意以下几个问题：

（1）本实验包括了荧光纳米材料硅量子点的合成和荧光光谱法检测维生素B12两部分，共需4 学时。学生通过动手操作合成荧光硅量子点，可以了解荧光纳米材料的基本合成方法，并重点掌握其微波合成方法。同时通过对荧光材料进行荧光光谱表征，加深学生对荧光产生机理的理解。学生利用合成的硅量子点检测维生素B12，可以了解常见的荧光检测机理和荧光光谱法的基本操作。本实验教学设计紧扣实验具体内容和具体环节，从合成到性质表征再到应用，环环相扣，逐步深入，可以使学生更加深入地理解荧光的产生机理，表现和影响因素［18］。实验过程可以采取学生单独完成，也可以采取小组合作的形式。

（2）由于大多本科生没有接触荧光纳米材料，对荧光检测机理也缺乏相关理论知识。为了帮助学生更好地理解实验内容，实验前教师可以先提供一些有关荧光纳米材料、荧光检测机理研究的资料，让学生阅读资料，进行预习，储备相关知识，才能更规范地进行实验操作。其中荧光纳米材料的相关资料可以包括半导体量子点、荧光碳基纳米材料、金属纳米簇、上转换纳米粒子等。荧光检测机理可以包括内滤效应、荧光能量转移、光诱导电子转移等。

（3）可以将硅量子点检测维生素B12的条件设计成探究性环节，教师不要将摸索好的检测条件提供给学生，而是让学生自己设计方案探讨最佳的荧光检测条件，多给学生思考和解决问题的机会。

（4）由于维生素B12在362 nm 处具有较强的吸收，可以利用紫外分光光度法测定维生素B12的含量。但和荧光光谱法相比，荧光光谱法的灵敏度更高，受干扰更小。因此，在实验设计上，可以将该实验进一步扩展为综合性、设计性实验“两种方法（紫外分光光度法和荧光光谱法）测定维生素B12药片的含量”，然后对比两种方法对实际样品的检测结果，加深对两种方法灵敏度的理解。