青蟹种间人工杂交技术建立及杂交子一代表型和遗传特征鉴定

马洪雨 ，吴清洋 ，谭华强 ，吴芳春 ，林 锋

（1.汕头大学广东省海洋生物技术重点实验室，广东 汕头 515063；2.汕头大学汕头大学-马来西亚登嘉楼大学虾蟹贝类联合实验室，广东 汕头 515063；3.饶平县西海岸生物科技有限公司，广东 饶平 515722）

在水产动物新品种选育过程中，杂交育种方法得到了广泛的应用，创造出了众多优质新品种，如：杂交鲂鲌“皖江1号”、罗非鱼“粤闽1号”、“福瑞鲤2号”、杂交鲟“鲟龙1号”等，提高了成活率、品质、抗逆性、生长速度等经济性状[1-2]，推动了我国水产种业高质量发展[3-4].“杂交翘嘴鲂”新品种是以雌性团头鲂和雄性翘嘴红鲌的杂交子一代为母本，以团头鲂为父本，连续杂交5代获得的新品种，该品种具有团头鲂的草食性和肉质鲜嫩特点，1龄鱼体重比团头鲂和翘嘴红鲌均提高20.0%以上，肌间刺比翘嘴红鲌减少7.7%[5].雌性团头鲂与雄性鱤杂交产生的子一代群体的可量性状和可数性状更偏向于母本团头鲂，线粒体基因组则与团头鲂完全一致[6].雌性大口黑鲈与雄性蓝鳃太阳鱼杂交产生的子一代的可数性状和可量性状均介于亲本之间，部分性状超越了双亲，5 S rDNA分析表明杂交子一代融合了双亲的基因组[7].鱼类杂交育种技术相对较成熟，但在虾蟹类中，杂交育种的理论和实践研究还处于起步阶段，可参考的资料较少.

拟穴青蟹属节肢动物门、软甲纲、十足目、梭子蟹科、青蟹属，具有肉味鲜美、营养价值高、市场需求大等特点.我国自120多年前便开始养殖拟穴青蟹，近年来，年产量在14万吨左右，产值达200多亿元.虽然我国已经突破了拟穴青蟹人工育苗技术，但还未达到稳定量产的水平，生产上还主要依赖从海区中捕捞野生苗种进行养殖.由于野生苗种存在数量和质量不稳定、规格不一致、易携带病菌、产量低等缺点，且养殖过程中面临不可预测的病害问题，导致养殖经济效益普遍较低，这极大地限制了我国青蟹养殖产业的健康发展.

锯缘青蟹与拟穴青蟹同属青蟹属，具有人工育苗成活率高、体型大、生长快、抗逆性强等特点，主要分布在越南、菲律宾、马来西亚及印度洋周边国家，我国仅在海南和广西发现有少量分布.2005年，日本学者Hideyuki Imai和Masatsune Takeda在日本发现了青蟹属的自然杂交种，后证实是锯缘青蟹和榄绿青蟹交配所生[8].2021年，马来西亚学者Fazhan等在马来西亚沙巴州发现了疑似青蟹种间杂交的4种不同子代[9].这些发现提示我们，青蟹属内不同物种间在自然条件下能够进行杂交并产生杂种后代.后继的研究进一步证实，紫螯青蟹、拟穴青蟹和榄绿青蟹在人工条件下可实现种间交配[10-11].目前，还未有拟穴青蟹和锯缘青蟹种间交配和繁育杂交子代的研究报道.若能建立拟穴青蟹和锯缘青蟹的种间杂交技术，则可将锯缘青蟹易繁殖、生长快速且体型大的优势性状引入拟穴青蟹中，有望改善拟穴青蟹人工繁殖成活率低、体型相对较小的不足，从而创造出品质好、营养丰富、成活率高、生长快、抗逆性强的优质新品种.

本研究以拟穴青蟹和锯缘青蟹为亲本，建立了种间人工杂交技术，获得了杂交子一代苗种，并通过肉眼和显微观察技术鉴定了杂种的表型特征，通过分子生物学技术鉴定了杂种的线粒体遗传特征.本研究将为进一步开展经济蟹类远缘杂交的理论研究和育种实践奠定坚实的基础.

1 材料与方法

1.1 亲本来源与养殖

拟穴青蟹来源于课题组自主培育的选育群体，锯缘青蟹购自海鲜市场.青蟹运送到养殖基地后，首先采用高锰酸钾溶液进行消毒处理并挑选出符合要求的候选亲本，然后养殖于陆基化养殖车间内，每个养殖单元养殖一只个体.挑选体型大的个体作为雌雄候选亲本，其中，未交配母本的挑选方法如下：观察雌蟹腹部边缘是否有明显的刚毛，若有，则为已交配雌蟹，若无，则为未交配雌蟹（图1）.养殖方法参照马洪雨等建立的青蟹陆基高密度循环水养殖技术[12].海水盐度保持在20-25 ppt之间，pH值在7.3-8.0之间，氨氮浓度低于0.5 mg/L，亚硝态氮浓度低于0.1 mg/L.车间内温度控制在25-28℃，以红肉蓝蛤或杂鱼为饵料，每天清除饵料残渣和粪便一次.

图1 青蟹未交配的雌蟹（A）和已交配的雌蟹（B）腹部特征

1.2 种间人工定向交配

定期巡查青蟹生长状态，当发现雌蟹即将或正在进行生殖蜕壳时，将其移入杂交箱内，同时放入一只健康的父本（若母本为锯缘青蟹，则放入雄性拟穴青蟹；反之，放入雄性锯缘青蟹），保持杂交箱的溶氧量和水质清洁，并提供黑暗环境.当母本完成生殖蜕壳后，二者可抱对交配，交配时间可持续1-2 d.

1.3 受孕母本的养殖、营养强化和抱卵母本培育

将交配成功的母本移入海水盐度为25-30 ppt的种蟹强化培育池中培育，具体方法参考马洪雨等建立的青蟹种蟹培育技术[13].种蟹的养殖密度为每平方米1只.以鲜活的螠蛏作为饵料，每天投喂一次，投喂量以第二天早晨剩余3-5个为宜.每天早晨换水一次，换水量为100%，干露1 h.当受孕母本卵巢发育成熟，便将卵排出体外并附着在腹部下方，此时称之为抱卵母本.将抱卵母本移至孵化桶中单独培育10-12 d，直至卵的颜色变为灰黑色或黑色时便可孵化出蚤状幼体.

1.4 杂交子一代幼体培育

将孵化出的蚤状幼体移至幼体培育池中进行培育，具体方法参考马洪雨等建立的青蟹室内水泥池人工育苗技术[13]，期间做好育苗过程中的饵料、水质、溶氧量、病害防控等管理工作.

1.5 杂交子一代表型特征鉴定

随机采集杂交子一代不同发育阶段的幼体和仔蟹，包括：蚤状幼体I期（Z1）、蚤状幼体II期（Z2）、蚤状幼体III期（Z3）、蚤状幼体IV期（Z4）、蚤状幼体V期（Z5）、大眼幼体期（M）、仔蟹 I期（C1）、仔蟹 II期（C2）、仔蟹 III期（C3）、仔蟹 VI期（C6）、仔蟹VII期（C7）.同时，以拟穴青蟹相同发育阶段的幼体和仔蟹作为对照，通过肉眼观察和借助显微镜技术鉴定不同发育时期的表型特征.

1.6 杂交子一代线粒体遗传特征鉴定

随机采取10只杂交子一代个体及雌雄亲本并提取基因组DNA，提取方法为传统的酚-氯仿提取法.特异性扩增线粒体细胞色素C氧化酶I亚基（COI）基因的PCR引物序列（COI-s:TTGACCCTGCTGGCGGTGG，COI-a:CAATTGAGGAGGGTAAAAATGGAG TAA）来自于Ma等[14]发表的论文，委托上海生工生物工程有限公司合成.PCR反应体系为 20 μL，包含：2 μL 10×反应缓冲液（含Mg2+），正、反向引物各 0.4 μL，1 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.4 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL）（北京全式金生物技术有限公司），0.5 μL DNA模板（50 ng/μL），ddH2O补齐至20 μL.PCR反应程序为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，54℃退火50 s，72℃延伸50 s，循环37次；72℃延伸7 min.采用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并送至上海生工生物工程有限公司测序.

从GenBank公共数据库中下载拟穴青蟹（Scylla paramamosain）、榄绿青蟹（Scylla olivacea）、紫螯青蟹（Scylla tranquebarica）、锯缘青蟹（Scylla serrata）、合浦绒螯蟹（Eriocheir hepuensis）、中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）及猛虾蛄（Harpiosquilla harpax）的COI序列，连同本实验的2个亲本及10个杂交子一代个体共计19条序列用于亲缘关系分析.采用MEGA7.0软件中的邻接法（neighbor-joining，NJ）构建系统进化树，经500次重复抽样，检验其置信度.设置猛虾蛄为外群.

2 结果与讨论

2.1 青蟹种间人工定向交配

本研究共开展了7对雌雄蟹的种间人工定向交配试验，全部实现了交配，成功率达100%，这说明拟穴青蟹和锯缘青蟹种间远缘交配是可行的（图2）.在自然界中，青蟹属4个物种间存在栖息地重叠的现象，并发现了种间自然杂交产生的后代，例如：在日本发现了锯缘青蟹和榄绿青蟹的杂交种[8]，在马来西亚发现了疑似青蟹种间杂交产生的4种不同杂交种[9].此外，马来西亚学者还开展了紫螯青蟹、拟穴青蟹和榄绿青蟹的人工交配试验，获得了成功[10-11].但到目前为止，还未见拟穴青蟹和锯缘青蟹种间杂交的研究报道，也未见在人工条件下获得青蟹杂交子代苗种的报道，本研究首次实现了在人工条件下拟穴青蟹与锯缘青蟹种间交配并通过人工育苗技术获得杂交子一代苗种.

图2 拟穴青蟹与锯缘青蟹交配（A）和即将孵化的锯缘青蟹受精卵（B）

2.2 青蟹杂交子一代苗种培育

本研究发现，受孕的锯缘青蟹母本卵巢能够发育成熟并顺利产卵，产卵后再经过15 d的强化培育后，在未进行交配的情况下能够第二次产卵并孵化出蚤状幼体，这说明青蟹交配一次后，精液可保存在雌蟹体内较长时间，并能够多次使用.而雌蟹在完成胚胎孵化后其卵巢可快速启动第二次发育并能够再次产卵并孵出幼体，这一发现夯实并拓展了青蟹繁殖生物学的内涵，为深入理解精液功能和卵巢发育机理提供了新思路，并为生产上充分利用受孕雌蟹培育人工苗种提供了实践指导.本研究中，锯缘青蟹雌蟹前后两次孵化出的蚤状幼体均在100万只左右，幼体数量大于相同规格拟穴青蟹的产幼数量，幼体体型也略大于同期的拟穴青蟹幼体，且幼体也相对更活跃.在幼体培育过程中，本研究适当加大了培育池中的溶氧量、饵料投喂量和换水频率，同时在蚤状幼体V期时对幼体进行分池培育，以保证幼体生长发育需求和成活率.

2.3 青蟹杂交子一代表型特征

采用扫描电镜对杂交子一代和拟穴青蟹的5个蚤状幼体期及大眼幼体期个体进行了表型特征鉴定，结果仅在蚤状幼体I期和大眼幼体的尾部发现刚毛数量存在一定的差异，未发现杂交子一代幼体与同期拟穴青蟹幼体之间存在明显差异（图3）.

图3 青蟹杂交子一代幼体与拟穴青蟹幼体的表型特征对比

采用普通光学显微镜对仔蟹I期个体进行观察鉴定，同时采用肉眼观察的方法对仔蟹II期、III期、VI期和VII期个体进行观察鉴定（图4）.结果发现，杂交子一代个体中存在少量的畸形个体，即双侧眼柄从眼窝中移位至前额，眼柄间距缩短.同时，在杂交子一代仔蟹II期和III期个体的步足上存在数个深颜色斑点，而在拟穴青蟹同期仔蟹中未发现这一特点.这些斑点随着发育的进行逐渐消失，VI期和VII期仔蟹与拟穴青蟹同期个体相比没有明显差异.此外，还发现杂交子一代个体比同期拟穴青蟹个体在体型和体重方面具有一定的优势，这可能与杂种优势有关.

图4 青蟹杂交子一代仔蟹期的表型特征

2.4 亲缘关系分析

通过对线粒体COI序列的扩增、测序和序列拼接等分析，最终获得的高质量序列长度为767 bp.序列比对分析表明，杂交子一代个体的COI序列与母本锯缘青蟹完全一致，而与父本拟穴青蟹之间存在差异，这表明杂交子一代个体的线粒体来源于母本锯缘青蟹，而非来自父本拟穴青蟹，从而证实它们是真正的杂交产生的后代.重建的系统进化树表明，它们与锯缘青蟹同属一个分支，而与拟穴青蟹位于不同的分支，这再次证明它们的线粒体来源于母本锯缘青蟹而非父本拟穴青蟹，这与线粒体的母性遗传特征完全吻合.线粒体的这一遗传特性还被用来进行物种鉴定，如：Ma等利用线粒体序列建立了鉴定青蟹属4个物种的技术，还建立了基于PCR技术的快速鉴定方法[15].

3 结论

本研究首次在人工条件下建立了拟穴青蟹和锯缘青蟹的种间杂交技术，通过室内人工育苗技术获得了杂交子一代苗种.表型鉴定未发现杂交子一代个体与拟穴青蟹间存在明显差异（极少数个体存在眼柄移位现象），遗传分析表明杂交子一代个体线粒体来自母本锯缘青蟹而非父本拟穴青蟹.该研究表明开展青蟹种间杂交从而培育杂交新品种具有一定的可行性.本研究为大规模开展青蟹种间杂交创新研究奠定了理论和技术支撑.

图5 杂交子一代个体、父本、母本的进化分析