太瑞斯梭孢壳霉磷脂酶C在玉米胚芽油脱胶中的应用研究

胡婷婷，王 灵，林康森，江正强，杨绍青

（中国农业大学 食品科学与营养工程学院，北京 100083）

玉米油富含多种脂肪酸，不饱和脂肪酸含量高达85%左右，其中亚油酸约占55%左右[1-2]。亚油酸作为一种人体自身不能合成的必需脂肪酸，具有降胆固醇、增强心血管机能、软化血管、预防和改善动脉硬化等功效[3]。经压榨离心制得的玉米胚芽油中磷脂含量较高，是毛油中主要的胶溶性杂质，这些杂质的存在不仅会降低油脂的流动性、使用价值和贮藏稳定性，而且在油脂精炼加工中还会导致成品油的质量下降。因此，在油脂精炼过程中需进一步去除磷脂组分[4]。

目前，植物油脂脱胶多采用传统脱胶方法，如水化脱胶和酸法脱胶等[5-6]。传统的脱胶方法可以有效地去除水化磷脂，但非水化磷脂很难去除[7]。酶法脱胶是通过添加磷脂酶将毛油中的非水化磷脂转变为水化磷脂，便于利用水化的方法除去[8]。常用于植物油脱胶的酶有磷脂酶 A1（PLA1）、磷脂酶 A2（PLA2）和磷脂酶 C（PLC）。PLA2由于脱胶效果不突出且价格昂贵应用较少，工业应用中多选择PLA1或PLC进行植物油脂脱胶[9-11]。其中PLC具有很多独特的优点，根据侧链基团的不同，磷脂酶C可以分为磷脂酰胆碱特异性磷脂酶 C（PC-PLC）、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C（PI-PLC）和非特异性磷脂酶C（NPC）。其中，PC-PLC可以特异性水解磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE），但对前者的底物特异性更好；PI-PLC只能特异性水解磷脂酰肌醇（PI），不能水解 PC；NPC则以普通磷脂为底物，可以水解PC、PE、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰甘油（PG）和磷脂酸（PA）[11]。PLC脱胶水解产物为有机磷酸酯（磷酸胆碱、磷酸乙醇胺或磷酸肌醇等）及甘油二酯，脱胶过程不产生其它副产物，安全性更高，且脱胶过程中仅需1%～2%的水分，极大减少了废水的产生，对环境污染相对较小，因此更受青睐[12]。目前，已有许多天然或重组PLC应用于不同毛油脱胶，如玉米胚芽油[13]、大豆毛油[14]、菜籽毛油[15]、米糠毛油[16]、山茶毛油[17]和蔬菜毛油[18]等。叶展等[19]利用PLC处理菜籽油，菜籽毛油磷含量由693 mg/kg降低至7.85 mg/kg。Cerminati等[20]将球形芽孢杆菌 PI-PLC和商业PC-PLC复配对大豆毛油进行脱胶，除去了约91%的磷脂。Jiang等[21]使用蜡状芽孢杆菌PLC对山茶毛油脱胶，磷含量降至6.84 mg/kg，脱磷率达到98.2%。同时，部分商业PLC（PLC Purifine®和PLC Lecitase Ultra）也被应用于毛油脱胶，包括大豆毛油和米糠毛油等[22-24]，但是关于玉米胚芽油酶法脱胶的报道相对较少[12,23]。

本课题组前期从太瑞斯梭孢壳霉（Thielavia terrestris）中克隆表达得到一种新型磷脂酶C。该酶应用于大豆毛油脱胶，能完全除去PC和 PI，仅有极少部分的 PE残留[11]。玉米胚芽油磷脂成分包括PC、PI、PA、PE等，主要为PC和PE，含量分别占20%以上。因此，使用对PC和PE底物特异性强的磷脂酶C利于脱胶完全[23]。本研究进一步探究该酶在玉米胚芽油脱胶工艺中的应用效果，优化玉米胚芽油毛油酶法脱胶工艺的主要参数，以期为该酶的后续工业化应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

玉米胚芽油（磷含量 102.7 mg/kg）：中粮东海粮油工业张家港有限公司；太瑞斯梭孢壳霉磷脂酶C（TtPLC）：中国农业大学酶工程实验室自制；重水 D2O、钼酸钠二水合物、氧化锌、硫酸联氨、脱氧胆酸钠等试剂均为分析纯：上海麦克林生化科技有限公司。

高速台式离心机（TGL 12GB）：上海安亭科学仪器厂公司；全温振荡培养箱（HZQ-F160）：江苏省太仓市实验设备厂公司；慧泰智能马弗炉（16-12TP）：上海慧泰仪器制造有限公司；封闭电炉（TDWYL-12）：沧州泰鼎恒业试验仪器有限公司；核磁共振波谱仪（Agilent 500 MHz DD2）：美国Agilent公司；水浴恒温振荡器（THZ-82A）、磁力加热搅拌器：江苏金坛市荣华仪器制造有限公司；紫外可见分光光度计（TU 1800 PC）：北京普析通用仪器设备有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 磷脂酶C的制备

参照Xiang等[11]方法制备太瑞斯梭孢壳霉磷脂酶 C。从本课题组筛选保藏的嗜热真菌太瑞斯梭孢壳霉ThielaviaterrestrisCAU709克隆得到磷脂酶C基因，将其在毕赤酵母中进行异源表达。依照Pichia Fermentation Process Guidelines（Version B，053002，Invitrogen）操作方法，在5 L发酵罐中进行高密度发酵制备磷脂酶 C，制备得到的磷脂酶C酶活力为98 970 U/mL。

1.2.2 磷脂酶C活力测定

采用对硝基苯磷脂酰胆碱（p-NPPC）法测定磷脂酶C酶活力：将20 μL适当稀释的酶液加入到96孔板中，再加入180 μL含10 mMp-NPPC的50 mM HEPES pH 6.5缓冲溶液于55 ℃培养箱静置。反应30 min后，使用酶标仪测定410 nm下吸光度值。磷脂酶 C酶活力单位（U）定义为在上述条件下每分钟反应产生1 μmol对硝基苯酚所需的酶量。

1.2.3 玉米胚芽油的酶法脱胶

磷脂酶C应用于玉米胚芽油的脱胶工艺参照Jiang等[25]的方法进行。称取300 g玉米胚芽油于1 L烧杯中，水浴加热至70 ℃，加入0.3 mL的柠檬酸溶液（45 %，w/w），在200 rpm条件下预热处理 20 min。然后冷却至预设温度（25～50 ℃），加入一定量的4% NaOH溶液（w/v，0.3～2.4 mL）调节pH，再加入3 mL蒸馏水和一定量的磷脂酶C纯酶液（0～10 000 U/kg），混合均匀后，在200 rpm摇床中反应（0～4 h）。反应结束后，将油样置于沸水浴中处理10 min终止酶反应，10 000 rpm离心10 min，取上层油样测定磷含量。以加入灭活的酶液处理组作为对照组。

1.2.4 磷含量测定

参照国标GB/T 5537—2008的方法测定磷含量。用坩埚称取3 g油样，加入0.5 g氧化锌在电炉上加热至碳化后，置于马弗炉中575 ℃灼烧2 h至完全灰化。取出坩埚冷却至室温，用10 mL盐酸溶液（50%，v/v）溶解灰分并加热至微沸，5 min后停止加热，待溶解液温度降至室温后过滤注入100 mL容量瓶中，用5 mL热水冲洗坩埚和滤纸3～4次，待滤液冷却至室温后用KOH溶液（50%，w/w）中和至出现混浊，缓慢滴加盐酸溶液（50%，v/v）使氧化锌沉淀全部溶解。最后用水稀释定容。吸取10 mL被测液到50 mL比色管中，加入8 mL硫酸联氨溶液（0.015%，w/v），2 mL 2.5%钼酸钠稀硫酸溶液（V(浓硫酸)∶V(水)=7∶25），加塞振摇3～4次，沸水浴处理10 min，冷却至室温后用水稀释至刻度并充分摇匀，静置10 min。最后用分光光度计测定溶液650 nm下吸光度值。

1.3 数据处理

采用Excel对实验数据进行分析，Origin 2018作图。

2 结果与分析

2.1 反应时间对脱胶效果的影响

在初始条件酶添加量为5 000 U/kg，NaOH和柠檬酸体积比为4，温度为35 ℃时，分别在反应时间为0.5、1、2、3和4 h下进行脱胶实验，以磷含量为指标，考察反应时间对玉米胚芽油脱胶效果的影响。实验结果见表 1，整体来看，随着反应时间的延长，磷含量逐渐下降，其中在0～1 h内油脂磷含量下降显著，反应1～4 h期间，磷含量变化趋于平缓。综合考虑脱胶率和脱胶时间，确定最佳反应时间为1 h。

反应时间对磷脂酶 C脱胶效果影响较大。Sampaio等[23]利用商业PLC Purifine®处理玉米胚芽油的最佳反应时间为2 h。Xiang等[11]进行大豆毛油磷脂脱胶时最佳的酶解时间与本研究结果一致。这是由于脱胶过程中磷脂发生凝聚，反应时间过短，磷脂凝聚不完全，脱胶率较低，随着反应时间的延长，脱胶效果提高，反应时间继续增加，脱胶效果不再提升，这是由于反应时间过长容易发生油脂乳化，不利于磷脂的分离[15]。此外，酶活性也会随着反应时间的延长而降低[8]。因此，适宜的反应时间能够提高酶法脱胶的效果。

2.2 NaOH和柠檬酸的体积比对脱胶效果的影响

在初始条件酶添加量为5 000 U/kg，温度为35 ℃，反应时间为 1 h，柠檬酸添加量为 0.1%（v/w）时，通过添加适量体积的NaOH来调节反应体系的pH，分别在NaOH和柠檬酸的体积比为1、2、4、6和8的条件下进行脱胶实验，以磷含量为指标，考察 pH对玉米胚芽油脱胶效果的影响。实验结果见图 1，随着 NaOH和柠檬酸体积比的增加，磷含量呈现先降低后升高的趋势，当NaOH和柠檬酸的体积比为4时，磷含量达到最低点。因此，确定NaOH和柠檬酸的最佳体积比为4。

图1 NaOH和柠檬酸的体积比对玉米胚芽油脱胶效果的影响Fig.1 Effect of volume ratio of NaOH to citric acid on the degumming efficiency of crude corn oil

不同的酸碱比对玉米胚芽油脱胶效果有很大的影响。Xiang等[11]应用磷脂酶C进行大豆毛油磷脂脱胶最佳酸碱体积比为1 : 2。毛程鑫等[26]用磷脂酶对菜籽油进行脱胶，最佳酸碱体积比为1 : 4.5。这可能是由于pH显著影响酶的活性及酶促反应速度，酶在其最适 pH条件下才能达到最高酶促反应水平，当酶在过低或过高pH条件下，酶结构会受到破坏，酶的活性随之降低甚至失去活性[8,20]。因此，采用适宜的酸碱比能有效提高酶法脱胶的效果。

2.3 温度对脱胶效果的影响

在初始条件酶添加量为5 000 U/kg，NaOH和柠檬酸的体积比为4，酶解时间为1 h时，分别在25、30、35、40、45和 50 ℃下进行脱胶实验，以磷含量为指标，考察温度对玉米胚芽油脱胶效果的影响。实验结果见图 2，随着反应温度的升高，磷含量呈现先降低后升高的趋势，当温度为35 ℃时，磷含量达到最低点。因此，确定最佳反应温度为35 ℃。

图2 温度对玉米胚芽油脱胶效果的影响Fig.2 Effect of temperature on the degumming efficiency of crude corn oil

温度也是影响酶法脱胶效果的重要因素之一。Qu等[9]进行大豆毛油酶法脱胶时的最佳反应温度为55 ℃。Jiang等[21]进行茶花籽油酶法脱胶的最适反应温度为 53 ℃。温度过低，油脂流动性降低，反应物分子间结合不充分，酶促反应较慢，随着温度的升高，油脂的流动性越好，反应物分子间结合越充分，酶促反应速度越快，但是温度过高会导致酶变性，使酶的活性降低甚至完全不可逆的丧失活性[16,21]。因此，适宜的温度范围能显著提高酶法脱胶效果。

2.4 酶添加量对脱胶效果的影响

在初始条件 NaOH和柠檬酸的体积比为 4，温度为35 ℃，水解时间为1 h时，分别在酶添加量为 0、1 000、2 500、5 000、7 500和 10 000 U/kg的条件下进行脱胶实验，以磷含量为指标，考察酶添加量对玉米胚芽油脱胶效果的影响。实验结果见图3，随着加酶量的增加，磷含量逐渐降低，当加酶量为5 000 U/kg时，磷含量达到最低点。综合考虑，确定PLC脱胶最适加酶量为5 000 U/kg。

图3 酶添加量对玉米胚芽油脱胶效果的影响Fig.3 Effect of enzyme dosage on the degumming efficiency of crude corn oil

本研究加酶量同Xiang等[11]大豆毛油磷脂脱胶结果一致，但是低于商业PLC Purifine®用于沙棘果油脱胶的酶添加量（12 000 U/kg）。这是由于在底物充足的情况下，酶促反应速度与酶浓度大小成正比。酶浓度越高，酶促反应速度越快，但是反应速度并不会一直随着酶添加量的上升而加快，因此，当酶的浓度达到一定值时，催化速率曲线逐渐趋于平缓，之后再继续增加酶的使用量时，反应速率不再明显变化[8]。

综上所述，采用磷脂酶C对玉米胚芽油进行磷脂脱胶的最佳条件为：酸碱比为 4、反应温度为35 ℃、反应时间为1 h、加酶量为5 000 U/kg。在该最优条件下，玉米胚芽油中磷的含量降低到24.0 mg/kg，水解率为76.6%。该酶的脱胶效果优于帝斯曼公司的 DSM磷脂酶 C（商业酶，64.70 mg/kg）[23]和商业 PLC Purifine®（27 mg/kg）[26]，稍差于其它几种磷脂酶（表2）。但是从柠檬酸的使用量来看，本研究中的使用量仅为其它脱胶工艺的50%左右（表2）。因此，综合考虑本研究的酶活力、脱胶效果和柠檬酸的用量，重组磷脂酶C（TtPLC）在玉米胚芽油脱胶工业中具有较大的应用潜力。

表2 部分磷脂酶酶法脱胶效率比较Table 2 Comparison of enzymatic degumming efficiencies of partial phospholipases

3 结论

采用自制的太瑞斯梭孢壳霉磷脂酶 C，优化了玉米胚芽油酶法脱胶工艺。得到最佳工艺参数为：NaOH和柠檬酸的体积比为 4、温度为35 ℃、加酶量为5 000 U/kg和水解时间1 h。在最佳条件下，玉米胚芽油脱胶效果显著，磷含量由 102.7 mg/kg降低至 24.0 mg/kg，水解率为76.6%。PLC脱胶不仅安全性高，水解产物为有机磷酸酯及甘油二酯，不产生其它副产品，而且环境友好，脱胶过程用水量少（仅需1%～2%的水分），可显著减少废水排放量。因此太瑞斯梭孢壳霉磷脂酶C在玉米胚芽油酶法脱胶工业中具有潜在的应用价值。