探讨血清学检测对羊布鲁氏菌病诊断的有效性

2021-05-29余海军罗代兵杨祎祎田新平

现代畜牧兽医 2021年5期

余海军，罗代兵，杨祎祎，田新平*

（1.碧江区农业农村局畜牧水产中心，贵州铜仁554300；2.天津农学院水产学院，天津市水生生态及养殖重点实验室，天津300384）

羊布鲁氏菌病（简称羊布病）是一种以布鲁氏菌为致病菌引起的人羊共患的传染性疾病[1]，其病菌对外部环境有较强的适应力、耐低温、耐干燥，能够长期生存于动物、水及土壤中。布鲁氏菌寄生在动物的细胞中，药物防控无效，发生流行后，不进行治疗，立即扑杀，无害化处理[2]。羊布病被世界动物卫生组织（OIE）列为B类动物疫病，在国内被列为二类动物疫病[3]，不仅对养羊产业发展造成极大影响，也对人畜造成不可低估的危害。目前，对羊布病常使用的实验室诊断方法为血清学检测，包括虎红平板凝集（RBT）、试管凝集（SAT）、胶体金免疫层析和酶联免疫吸附试验。本研究基于虎红平板凝集试验初筛定性、试管凝集和酶联免疫吸附试验复检定量，对御诺乳业奶山羊场438份样本进行血清学分析研究，探究其对于羊布病检测的有效性，为及时了解和掌握羊布病的疫情动态、做好羊布病有效防控措施提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

本研究在贵州省铜仁市碧江区御诺乳业奶山羊场采集羊血液样本，将采集的438份样本分别标号（A1-A81、B1-B112、C1-C56、C61-C98、D1-D151）放置于37℃恒温培养箱中隔夜培养，待其分离血清，用于后续的血清学研究。

1.2 血清学检测方法

1.2.1 虎红平板凝集试验

取30μL虎红平板凝集抗原于检查卡上，分别与等体积的受检血清和标准阳性血清混匀，室温静置5 min，观察结果。

1.2.2 试管凝集试验

本研究采用微量法对虎红平板凝集试验筛选出的阳性样本，按照《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T 18646—2018）操作测定[4]。第一步将受检血清和抗原对照在U型板中稀释，每份血清有4孔；第二步将稀释的抗原100μL加入第一步稀释好的血清中，稀释度为1∶25、1∶50、1∶75、1∶100；第三步将试验组和对照组充分混匀后，放于37℃恒温培养箱中培养24 h，室温放置2 h，观察结果。

1.2.3 酶联免疫吸附试验

本研究选用竞争性ELISA抗体检测试验对虎红平板凝集试验筛选出的阳性样本进行检测，具体步骤按照试剂盒说明书操作，最后使用酶标仪对受检血清、标准阳性、阴性血清进行OD值的测定。

1.3 结果判定

虎红平板凝集试验根据检查卡中出现不同程度的颗粒状或玫瑰花瓣状凝集，判定为标准阳性血清，而标准阴性血清无变化。

试管凝集试验根据受检血清出现1孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底，2~4孔孔底均呈现白色点状凝集，判定为可疑；受检血清出现1、2孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底，3、4孔孔底呈现白色点状凝集，判定为阳性；受检血清出现1~4孔孔底均呈现白色点状，判定为阴性。

竞争性ELISA抗体检测试验结果根据酶标仪测定450 nm波长处的OD值，按照以下公式计算数据以判定结果。

式中：ODNC为阴性血清的平均OD值；ODPC为阳性血清的平均OD值；ODS为受检血清的OD值；当ODNC>0.5，且阳性血清抑制率>60%时，试验结果有效，否则重新试验；当样本抑制率≥50%判定为阳性，否则为阴性。

2 结果与分析

2.1 虎红平板凝集试验结果（见图1）

在布病血清学检测研究中，虎红平板凝集试验操作简单、耗时短，由于其敏感性高、特异性低，因而被广泛用于布病的初筛[5-7]。由图1可知，本试验438份羊血清，虎红平板凝集试验初筛147份阳性，291份阴性。

2.2 试管凝集试验结果（见图2）

试管凝集试验对初筛的147份阳性样品进行复核。由图2可知，A14、B37、C72、D65、D75、D76、D80、D90、D93、D116为阴性，D131为可疑，其余136份均为阳性。

2.3 竞争性ELISA抗体检测试验结果（见图3）

对147份初筛阳性血清进行竞争性ELISA抗体检测试验。由图3可知，ODNC为0.825 5，阳性血清抑制率为89.30%（0.737/0.825 5），判定试验结果有效，样本抑制率约为0.413（即样本OD值≤0.413为阳性，反之为阴性）；通过复核筛选出136份阳性，11份阴性。

3 讨论

羊布病严重影响羊养殖产业发展，因此针对布病的诊断和综合防控，有利于保障养殖产业的经济效益[8]。目前，布病的诊断检测存在着2种方法，即血清学检测和病原学检测。病原学是通过从疑似患病羊组织、乳汁、分泌物中分离出菌落，涂片染色镜检，根据菌落颜色诊断[9-10]；但由于此方法周期长、操作技术和实验室设备要求高、试验人员存在感染风险，不能广泛推广应用[11-12]。血清学检测是通过从疑似患病羊血液中分离血清，与抗原试剂混合反应，根据理化反应现象和试验仪器数据读取诊断。对比病原学检测，血清学检测周期短、试验仪器要求不高、降低试验人员的感染风险。因此，在国内外均采用血清学试验检测布病[13]。

本研究采用血清学检测对羊布病进行诊断，通过虎红平板凝集对438份样本初筛，试管凝集和竞争性ELISA抗体检测对初筛的阳性样本进行复核。结果表明，虎红平板初筛出147份阳性样本，试管凝集复核阳性样本有136份、可疑1份；竞争性ELISA抗体检测复核有136份，诊断率达92.5%，在一定程度上证明血清学检测对于羊布病诊断具有有效性。同时，在血清学分析中发现，D131样本ELISA抗体检测结果为0.470，大于样本抑制率，故可以诊断为阴性样本；而试管凝集结果显示其属于可疑样本，无法诊断其阴、阳性，对照虎红平板结果也无法诊断，结果见图4。基于以上结果，可以推断出在布病阳性样本复核中，竞争性ELISA抗体检测灵敏度高于试管凝集检测，与齐景文等[14]提出的观点一致，即ELISA抗体检测用于羊布病复核较为理想。

由于缺乏基础研究，对于羊布病缺乏准确的诊断手段，同时也严重阻碍与之相关的净化研究和发展。羊布病研究工作者任重道远，还有大量的基础研究任务需要完成。因此，需要更多的研究人员参与研究，为动物科学、农业科学和环境科学等学科提供有效且可信的科研资料，为布病深入研究提供参考。