肉羊鲜精常温保存技术的研究

2021-05-29张良斌贺心康刘自运布鲁呼木图张新杰翟太宇张仙保

现代畜牧兽医 2021年5期

张良斌，贺心康，刘自运，柴局，布鲁呼木图，张新杰，翟太宇，张仙保*

（1.包头市农牧业科学研究院，内蒙古包头014013；2.包头市九原区家畜改良工作站，内蒙古包头014000；3.包头市九原区动物检疫监督所，内蒙古包头014000；4.包头市城乡统筹一体化促进中心，内蒙古包头014000）

随着畜牧业产业化的发展，生产优质肉羊是适应国际市场的需要。我国的肉羊产业起步较晚，目前还没有形成肉羊的繁育体系。肉羊品种多为地方品种，产肉性能较差、羊肉品质也较低、市场的竞争力相对较弱。近年来，我国已引入德国肉用美利奴、南非肉用美利奴、杜泊、萨福克、特克塞尔、无角道赛特等优质肉羊品种，利用引入的肉羊品种与当地绵羊品种杂交进行改良，取得较好的养殖生产效果[1]。为提高引进肉用种公羊的利用率，逐渐扩大肉用羊的繁育数量，采用鲜精低温保存的方法进行人工授精是比较直接有效的方法。鲜精低温保存技术延长肉羊精子的存活时间，提高了优良种公羊精液的利用率，扩大配种范围[2]。但是，采用低温保存的精液解冻之后，精子的活性以及精子的完整率均较低，对于后期受精率有较大影响[3]，且冷冻保存的条件较为苛刻，通常是在4℃低温保存[4-5]，输精需要携带冰箱，导致工作人员的工作强度较大、成本较高。

养殖生产中，为解决精液保存问题，本试验通过参考鲜精低温保存技术[6]，以卵黄和海藻糖作为单一变量进行研究，从而确定肉羊鲜精常温保存配方，保证运输与人工授精的时间和精子活率。

1 材料与方法

1.1 试验材料

卵黄（鸡蛋）购自当地超市，自生产日期不超过15 d。

三羟基氨基甲烷（Tris）、柠檬酸钠、维生素C、还原型谷胱甘肽、牛血清白蛋白、三磷酸腺苷（ATP）、青霉素、链霉素、海藻糖均购自北京酷来搏科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 精液的采集

试验羊由包头市九原区鑫泰农业科技有限责任公司提供，为膘情中等、体质健康、性欲旺盛的无角多赛特种羊，卵黄组和海藻糖组各5只，每只羊做3个重复。

使用假阴道法采集精液，确保精液不受污染，将采集的精液在放置显微镜下观察并测定精子的活率，镜检合格后进行常规品质评定。精子活率大于80%、无异味、色泽纯白或灰白，作为试验样品。

1.2.2 精液活率的测定

将检测合格的种公羊精液与37℃预热的稀释液按照1∶3的比例进行稀释，稀释过程中要保证温度稳定在37℃左右，以免温差造成精子活率下降。分别比较在保存第1、2、3、4 d精子的活率，保存方式为常温（20~25℃）保存。

精子活率检测：将稀释精液摇匀后取10μL中层精液滴于经预热的37℃恒温血细胞计数板上，盖片后置于显微镜下放大400倍，检查精子总量和活精数量，计算精子活率。

1.2.3 精液缓冲剂的配制

卵黄组：取3~9 g Tris、0.8~2.8 g柠檬酸钠、0.1~0.8 g维生素C、0.01~0.09 g还原型谷胱甘肽、0.06~0.28 g牛血清白蛋白、0.02~0.15 g ATP、10~80万IU青霉素、5~30万IU链霉素、海藻糖1.75 g加入20 mL双蒸水，用玻璃棒搅拌均匀。将鸡蛋打入干净烧杯（鸡蛋不可打散），用没有针头的注射器插入蛋黄内吸取蛋黄液加入上一步配制的液体中，组配制好的溶液加入双蒸水配制为100 mL的溶液，用玻璃棒搅拌混匀。蛋黄分5组，每组加入量分别为5、10、15、20、25 mL。

海藻糖组：卵黄15 mL，海藻糖分为6组，每组加入量分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g；剩余物质的含量与卵黄组成分一致。

1.3 数据统计与分析

利用SPSS 25.0软件对试验所得数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA），采用邓肯氏法对组间数据进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示。P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同含量海藻糖对肉羊精子活率的影响（见表1）

使用血液计数板按照24 h间隔对精液进行检测，共检测4 d的样本。

由表1可知，24 h检测显示，6个不同含量的海藻糖条件下精子活率均高于80%，96 h检测结果显示，6个不同含量的海藻糖条件下精子活率均高于40%，其中海藻糖含量在2 g时，精子活率最高，达52.56%。24、48、96 h时，海藻糖含量为2 g时，肉羊精子活力最高（P<0.05）；72 h时，海藻糖含量为1.5 g时，肉羊精子活力最高（P<0.05）。

表1 不同含量海藻糖对肉羊精子活率的影响Tab.1 Effects of different trehalose content on sheep sperm motility 单位：%

2.2 不同含量卵黄对肉羊精子活率的影响（见表2）

由表2可知，24 h检测结果显示，5个含量卵黄条件的精子活率均高于80%，10 mL卵黄含量下，高达92.37%；96 h检测结果显示，5个含量卵黄条件下的精子活率均高于40%，其中卵黄含量为10 mL时，精子活率最高，达56.04%。

表2 不同含量卵黄对肉羊精子活率的影响Tab.2 Effect of different egg yolk content on sheep sperm motility 单位：%

3 讨论

20世纪50年代，-79℃条件下，绵羊精液保存技术获得较高的存活率[7]，但产羔率仅5%，说明冷冻后的精液虽然有较高的存活率，但是精子的受精能力却遭到严重破坏。在0~4℃的低温保存下，绵羊精子可存活长达167 h[3-4]。费俊阳等[6]研究表明，在0℃冰水混合的条件下，精子保存12 d的活率在70%以上。孔凡虎等[8]报道，鲜精常温保存（20~25℃）中稀释液的成分主要包括糖类、奶类、卵黄、缓冲物质、抗生素及其他成分。本试验中，糖类选择海藻糖，海藻糖能有效维持细胞内生物膜、蛋白质、活性肽的稳定性和完整性。海藻糖不仅是稳定性的双糖，在代谢过程中也是主要提供能量的物质；还能有效保护DNA，保证精子基因的完整性[9-10]。由于当前市场上的牛奶大多含有防腐剂等成分，会影响精子的活性，使用鲜奶保存精液的限制性较大。因此，选择鸡蛋维持精子活力、保护精子顶体等，鸡蛋即不含化学添加物，又能保证无菌性[11]。

本试验选择11月份进行试验，主要是在本地区该时间段是养殖场进行同期发情和人工授精等的交配期，该时期进行试验能够与生产实际应用紧密结合。本试验从2019年2月开始。前期包括对采精方式进行探索，包括使用附睾孵育法、电刺激采经法以及假阴道采精法。3种方法中，附睾孵育法对于试验要求比较严格。据报道，公羊附睾的精子要比射出精液的精子对冷刺激适应性强[12-13]。但是，由于精子含量以及精子的活跃状态均明显比另外2种方法差，因此该试验方法首先被淘汰。电刺激采精[14]由于具有麻痹性而且是被动射精，影响精液的品质[15-16]，因此得到的精液浓度低，精子活性也较低。最终，本试验选用假阴道采精法进行采精。

本次试验结果相对稳定。不同含量卵黄条件下，卵黄含量为10 mL时，精子活率的稳定性以及第4 d数值均比较好，第4 d的精子活率在50%以上，符合实际生产中授精的活力必须高于40%。不同含量海藻糖条件下，海藻糖含量为2 g时，精子活率在4 d连续测试的活率处于5个含量梯度最高，并且降幅相对稳定，在第4 d高于50%以上，也符合实际生产需求。研究发现，在72 h时1.5 g海藻糖条件下要比2 g含量下精子活率略高，可能由于在该时间段2 g海藻糖含量略大，精子内外渗透压要比1.5 g含量的高，对精子吸收外界的物质均有影响，而低含量下的海藻糖会对精子受渗透压的影响较小。高渗压会使精子轻度脱水，减缓新陈代谢速度，使活性精子运动减少[17]，会引起细胞器和细胞膜受损[18]，导致细胞膜上的磷脂质丢失严重[19]，并会改变胞内pH值[20-21]，增加精子的死亡率。因此，下一步研究应该考虑精子受渗透压的影响，探讨各种保存剂的最佳浓度。