藏羊肺脏中HIF-1α的表达及其高原适应性研究

2021-05-29李帅帅张雨欣王子懿阿依木古丽阿不都热依木

现代畜牧兽医 2021年5期

李帅帅，张晨，张雨欣，邓茵，王子懿，阿依木古丽·阿不都热依木

（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030）

藏羊又称藏系羊（Tibetan sheep），是我国特有的牛科品种。藏羊体质强壮、抗严寒、耐粗饲，广泛分布于海拔3 000~5 000 m的青藏高原地区。海拔高度与大气含氧量呈负相关性变化，海拔越高，大气含氧量越低[1]。藏羊长期生活在高海拔、低氧、严寒的环境中。藏羊经过长期的生物进化，对低氧、高寒、气候多变的环境有很强的适应性，是高原牧区重要的经济支柱。

缺氧诱导因子，也称低氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF），普遍存在于哺乳动物细胞内，是一种异源二聚体，主要由HIF-α和HIF-β2个亚单位组成。研究发现，缺氧诱导因子是细胞内对缺氧适应性反应的一种关键转录调控因子[2]。HIF-1α的激活在缺氧早期促进下游基因，如促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等的表达，促进组织缺氧时细胞的存活；但严重缺氧或长期缺氧则导致下游基因如Bcl-2相互作用蛋白3（BNIP3）和NIX的表达增加，促进细胞凋亡和坏死；同时也能通过稳定p53的表达，引起细胞的凋亡。大鼠心肌细胞缺氧会导致HIF-1αmRNA及蛋白水平均显著增加[3]。HIF-α在血管丰富的心、肺等组织中表达较强，在血管内皮细胞、胎肺成纤维细胞系等血流丰富的组织细胞中含量较高，而在白细胞系中含量较低[4]。HIF在动物低氧适应方面起着重要作用，然而具体的分子机制还不清楚。因此，本试验拟通过组织学染色，观察不同海拔生活的藏羊肺脏组织结构特点，并用免疫组织化学SP法和实时荧光定量PCR法检测其HIF-1α的表达差异，为进一步研究藏羊高原适应性机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

藏羊样品采自青海主月畜牧业屠宰场（海拔高度3 900 m）和甘南鑫旺屠宰场（海拔高度2 900 m）。选择健康、1~2岁藏羊各5只，断颈处死，检查胸腔和腹腔无可视病理变化，取肺组织1 cm3，4%多聚甲醛固定，24 h后更换固定液复固定，保存备用。

1.2 试验方法

染色切片每组随机抽取5张切片，每张切片在400倍视野随机选择10个不同区域，用Image Proplus6.0软件测量肺被膜厚度、肺泡大小、单位面积（1 mm2）内肺泡与肺泡囊数量、并测量肺泡隔厚度。Gomori醛品红染色切片中测量肺被膜弹性纤维厚度，按（肺弹性纤维厚度/肺被膜厚度）×100%计算肺被膜弹性纤维百分比。免疫组织化学SP染色切片检测免疫阳性产物光密度值（IOD）。

1.2.1 组织学染色

各组肺组织常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片，厚度为5μm；一部分切片用于常规H.E染色和Gomori醛品红染色；另一部分用于免疫组织化学染色。

Gomori醛品红染色：酸化高锰酸钾氧化5 min，2%草酸漂白1 min，醛品红染色15 min，70%酒精洗涤3次；橙黄G溶液滴染30 s，水洗终止染色，常规脱水、透明，中性树胶封片。

1.2.2 免疫组织化学染色

切片脱蜡至水，采用微波柠檬酸抗原液修复法使抗原修复[5-6]，滴加A液室温避光孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶，PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min；滴加B液，室温孵育30 min，加入一抗室温孵育1 h（阴性对照组用PBS缓冲液替代一抗），PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min；最后滴加D液室温孵育20 min，DAB显色，显微镜观察；最后苏木素复染，自来水反蓝（复染细胞核），常规脱水、透明，中性树胶封片。阳性呈黄褐色，阴性对照不着色。

1.3 数据统计与分析

数据采用SPSS 22软件SSR法统计分析，数据用“平均值±标准差”表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 不同海拔藏羊肺组织结构差异（见图1、表1、表2）

由图1可知，藏羊肺被覆浆膜，主要由疏松结缔组织构成，富含弹性纤维。藏羊肺泡上皮主要以单层扁平上皮为主，肺泡隔中含大量毛细血管。

由表1可知，较高海拔藏羊肺被膜厚度与较低海拔藏羊比较差异不显著（P>0.05），但较高海拔藏羊被膜中弹性纤维含量极显著高于较低海拔藏羊（P<0.01）。

表1 不同海拔藏羊肺脏被膜厚度及弹性纤维含量比较Tab.1 Comparison of lung sac thickness and elastic fiber content of Tibetan sheep at different altitudes

表2 不同海拔藏羊肺泡及肺泡隔比较Tab.2 Comparison of alveolar and alveolar septum of Tibetan sheep at different altitudes

由表2可知，较高海拔藏羊与较低海拔藏羊肺泡大小、单位面积内肺泡数量均无显著差异（P>0.05），但较高海拔藏羊单位面积内肺泡囊数量（1 mm2面积内）、肺泡隔厚度、肺泡隔中毛细血管数量均显著高于较低海拔藏羊（P<0.05）。

2.2 不同海拔藏羊肺脏中HIF-1α的表达差异（见图2）

由图2可知，HIF-1α蛋白在肺脏细支气管黏膜表达强度较强，微动脉内皮也有表达，肺泡隔中有少量表达。HIF-1α在细胞中主要位于细胞质中，细胞核内未见，较高海拔藏羊肺脏中HIF-1α蛋白的表达量高于较低海拔藏羊。

3 讨论

高原动物在长期自然进化中为适应高原低氧环境，在形态学及生理学方面均表现出一些不同于平原动物的特点[7-8]，尤其以心血管系统和呼吸系统的变化较为明显。低氧是高原生存的不利因素之一。HIF是氧信号转导系统的重要转录因子，在细胞的低氧应答中起着关键作用[9]，通过调控靶基因，产生一系列应答反应，如增加红细胞数量、调节葡萄糖代谢等。常氧下HIF蛋白也有表达，但很快被细胞内氧依赖性泛素蛋白酶降解，只有在缺氧条件下才会稳定表达[10]。动物在缺氧环境中，细胞内HIF-1α蛋白水平可在短时间内迅速上升，如牦牛[11]、藏鸡[12]以及人类[13]等。肺被膜中丰富的弹性纤维可有效提高肺脏回缩力，有利于肺残气排出，提高肺通气效率[14]。本试验发现，较高海拔藏羊和较低海拔藏羊肺表面被膜厚度无显著差异，但肺被膜中弹性纤维含量较高海拔藏羊显著多于较低海拔藏羊，可能与藏羊能适应较高海拔有关。研究表明，肺泡中丰富的毛细血管可以显著提高肺泡的交换效率[15]。本试验发现，较高海拔藏羊肺泡隔和肺泡隔中毛细血管含量显著高于较低海拔藏羊。