坏死性凋亡机制及在结直肠肿瘤中的研究进展

胡建生 王雯 刘海旺 张欣颖 孙林梅

1西安市中医医院肛肠科（西安710016）；2西安交通大学护理系（西安710061）；3西安市第九医院普外科（西安710054）

结直肠肿瘤是全球常见恶性肿瘤之一，发病率排名第3位（10.2%），死亡率第2（9.2%），近十年发病率和死亡率不断上升［1］，随着社会的发展，预计到2035年全球结直肠肿瘤发病率将增加到250万例［2］，而我国的结直肠肿瘤发病率居常见恶性肿瘤第3位（9.89%）［3］，结直肠肿瘤已然成为我国重要的公共卫生问题之一。目前治疗结直肠肿瘤主要以手术、化疗、放疗为主，虽然诊断和治疗等方面快速发展，但预后仍不容乐观，主要原因之一是化疗耐药，在肿瘤患者中约80%～90%的死因归结于直接或间接的耐药性［4］，抑制细胞凋亡、肿瘤细胞异质性和肿瘤干细胞等因素均可导致化疗耐药，目前针对肿瘤的耐药性仍缺乏有效的改进方案［5］。

凋亡是生物体内普遍存在的一种细胞死亡方式，传统化疗药物主要通过诱导肿瘤细胞发生细胞凋亡来抑制肿瘤的生长［6］，然而肿瘤细胞往往由于自身凋亡机制失调而产生一定耐药性。随着对细胞死亡机制的深入研究，越来越多新的细胞死亡方式被不断发现和报道，DEGTEREV A等［7］首次报道并命名了一种新型细胞死亡模式——坏死性凋亡（Necroptosis）。这是一种由丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1/3（RIPK1/RIPK3）介导的磷酸化信号通路激活混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL/pMLKL）为特征的细胞死亡模式，与细胞凋亡有共同的途径［8-9］。此种模式具有坏死样细胞死亡的形态学特点，表现为溶酶体膜降解，细胞质空泡化，质膜解体，最终细胞爆炸样破裂。目前研究已经证实坏死性凋亡在包括IBD、动脉粥样硬化，多种皮肤疾病、急性肾损伤和炎症反应综合征（SIRS）在内的多种炎症性疾病中起重要作用［10-11］。最近研究认为对细胞凋亡具有抗性的肿瘤细胞可能对坏死性凋亡途径敏感［12-13］，提示研究肿瘤细胞坏死性凋亡及其调控机制有望成为结直肠肿瘤治疗的靶点（表1）。

表1 坏死性凋亡的关键调节分子和其功能Tab.1 Key mediators in necroptosis and their function

1 坏死性凋亡的分子调节机制

程序性细胞死亡（即凋亡和坏死性凋亡）模式是由RIPK1通过其激酶功能驱动，包括通过形成复合物IIa导致细胞凋亡和形成复合物IIb导致细胞坏死性凋亡。对坏死性凋亡分子机制的了解主要来自对TNFR1引发的信号通路的研究，肿瘤坏死因子（TNF⁃α）与TNFR相互作用后，TNFR1开始募集下游蛋白分子TNFR1相关的死亡结构域（TNFR1⁃associated death domain protein，TRADD、RIPK1、cIAPs（cellular inhibitor of apoptosis pro⁃teins）、TRAF2/5（TNFR⁃associated factor 2/5）和LU⁃BAC（linear ubiquitin chain assembly complex）蛋白形成复合体I，复合体I中RIPK1多聚泛素化并激活NF⁃κB（nuclear factor⁃κB）和MAPK（mitogen⁃acti⁃vatedprotein kinase）信号通路，抑制caspase⁃8的激活，使得细胞存活。

若TNF⁃α募集TRADD、Fas相关死亡结构域FADD、pro⁃Caspase⁃8和RIPK1组成复合体IIa，复合体IIa促进caspase 8的激活，激活的caspase 8通过激活Caspase 3而发生细胞凋亡［14-16］。当caspase⁃8被抑制或其活性水平相对较低时，RIPK1募集RIPK3，两者通过RHIM（RIP homotypic interaction motif）募集MLKL形成复合物IIb，又称为坏死体（necrosome）［9］，MLKL的T357和S358位点磷酸化而激活，MLKL磷酸化会引起寡聚化和膜定位。寡聚化的MLKL具有与脂质（心肌磷脂、磷酸肌醇）直接结合的能力，使得聚合的MLKL形成膜通透性孔道，细胞膜完整性被破坏，发生坏死性凋亡（图1）［17-18，38］。有研究认为［7，19］RIPK1在复合物Ⅰ中并无激酶活性，通过坏死性凋亡抑制剂（necro⁃statin⁃1）抑制RIPK1活性对TNF诱导的NF⁃κB信号通路并无影响，然而却可阻止复合物IIb的形成来抑制坏死性凋亡，因此RIPK1在细胞中的作用可通过靶向药物来决定细胞是存活还是发生坏死性凋亡。

2 坏死性凋亡与结直肠肿瘤的关系

2.1 坏死性凋亡双向调节肿瘤发生发展坏死性凋亡在肿瘤细胞发生、发展中发挥着双重作用。一方面坏死性凋亡可抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。ZENG等［20］研究中分析了40例结直肠腺癌患者肿瘤样本中RIPK1蛋白和mRNA水平均显著上调，而RIPK3和p⁃MLKL在结直肠癌中减少，认为在肿瘤细胞中坏死性凋亡可能减少，凋亡可能增加。FENG等［21］研究发现RIPK3在结直肠癌组织中表达明显低于癌旁正常组织，RIPK3上调可抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。然而LIU等［22］研究小鼠炎性肠癌（CAC）模型中发现肿瘤中RIPK3呈高表达，并进一步分析168个肿瘤和103个非肿瘤对照的结肠癌组织芯片，发现RIPK3在人类结直肠癌中高表达，而在删除小鼠RIPK3基因后肿瘤数量和大小明显减少，肿瘤负荷随之减少，通过肠炎小鼠模型实验证明RIPK3可能参与早期肿瘤的生长。基于上述研究结果，目前研究认为坏死性凋亡是一把双刃剑，RIPK3在结直肠癌组织中作用仍需多中心、前瞻性临床对照实验进行证实。

2.2 坏死性凋亡在肿瘤治疗的应用坏死性凋亡已成为机体对病原体、炎症和免疫的重要调节路径，多种刺激可触发细胞的坏死性凋亡［23］，一旦促凋亡分子不能刺激凋亡小体，就会触发依赖于激酶活性RIPK1和RIPK3介导的坏死性凋亡［24］。凋亡诱导剂在很大程度上与癌症耐药相关，通过非凋亡途径杀死肿瘤细胞的药物可以绕过传统的耐药，RIPK1和RIPK3是细胞死亡和存活途径的关键分子［25］，是治疗结直肠癌的潜在重要靶点。

图1 坏死性凋亡在结直肠肿瘤中作用机制Fig.1 Molecular regulation mechanism of cell necroptosis in colorectal cancer

2.2.1 药物靶向治疗Nec⁃1（Necrostatin⁃1）是一种通过阻止RIPK1和RIPK3的相互作用的特异性坏死性凋亡抑制剂，可特异性抑制坏死性凋亡而不影响正常细胞功能和细胞凋亡，LIU等［26］通过结肠炎相关癌（CAC）鼠模型研究了Nec⁃1的抗肿瘤作用，认为Nec⁃1可通过抑制JNK/c⁃Jun信号通路显著抑制肿瘤的生长和发展，同时一批具有坏死性凋亡抑制活性的necrostatins相关化合物，包括Nec⁃3、Nec⁃4、Nec⁃5、Nec⁃7等也逐渐被深入研究。

细胞FLICE（FADD⁃like IL⁃1β⁃converting en⁃zyme）抑制蛋白（c⁃FLIP）是一种主要的抗凋亡蛋白，也是一种抑制细胞因子和化疗诱导的细胞凋亡的重要细胞因子和化疗耐药因子。有研究称c⁃FLIP在结直肠癌中表达水平升高［27］，c⁃FLIP异构体参与切换凋亡和坏死细胞死亡［28］，核糖体中的c⁃FLIP异构体决定细胞的死亡是否发生RIPK3介导的坏性凋亡死或caspase依赖介导的凋亡。

筛选坏死性凋亡诱导物也是一种针对肿瘤细胞耐药的新策略，HAN等［29］研究发现酯蟾毒配基（Resibufogenin）通过诱导RIPK3介导的激活糖原磷酸化酶（PYGL）、谷氨酰胺合成酶（GLUL）和谷氨酸脱氢酶（GLUDl）的活性来诱导CRC细胞坏死从而抑制肿瘤生长，说明RIPK3不仅是坏死细胞的分子开关，而且是控制细胞代谢状态的枢纽［30-31］。HAN等［32］通过实验证明紫草素对药物敏感的癌细胞株（MCF⁃7和HEK293）及耐药细胞系（过度表达P⁃糖蛋白、Bcl⁃2或Bcl⁃x L，这是临床肿瘤耐药的主要原因）表现出同样的坏死性凋亡，证明紫草素等化合物可诱导耐药癌细胞株坏死细胞死亡，从而抑制耐药。DI等［33］研究FMRP蛋白（The Fragile X Mental Retardation Protein）与受体相互作用的蛋白激酶1（RIPK1）mRNA结合，提示FMRP通过监测RIPK1 mRNA的代谢来调节坏死性凋亡通路。使用FMR1抗转录治疗CRC细胞系会使RIPK1上调，使CRC细胞发生坏死性凋亡。综上可见，坏死性凋亡易感性是肿瘤细胞的内在弱点，因此发掘靶蛋白和坏死诱导物对结直肠肿瘤的临床治疗具有重要意义。

2.2.2 放疗放射治疗是治疗癌症的主要方法之一，超过50%的肿瘤患者在其疾病治疗过程中接受了放疗，其中40%可以通过放疗治愈［34］，然而，肿瘤再发仍然是治疗失败的关键因素之一［35］。WANG等［36］首次研究表明，辐射诱发的坏死性凋亡是通过上调RIPK1和RIPK3的磷酸化，导致RIP1/RIP3/MLKL坏死体的形成。小剂量化学抑制剂或基因缺失对坏死性凋亡调节基因，特别是MLKL的阻断可显著抑制小鼠体内外的肿瘤再发，甚至降低小鼠的致瘤性，检测HT29和SW480细胞来源的结直肠癌细胞在照射后IL⁃8增加，提出了一个新的途径——RIP1/RIP3/MLKL/JNK/IL⁃8参与坏死细胞介导的肿瘤再增殖，MLKL/JNK/IL⁃8可能成为阻断肿瘤再聚和提高放疗疗效的潜在靶点。上述研究提示针对坏死性凋亡的放疗方案可能成为提高放疗效果的有效方式。

2.2.3 其他治疗一些复合物被证实可诱导肿瘤细胞发生坏死性凋亡发挥抗肿瘤作用，但仍局限与基础研究。FANG等［37］研究通过以Survivin⁃XIAP复合物为靶点的多肽Su⁃X来诱导肿瘤细胞的坏死性凋亡，经过Su⁃X处理的细胞中坏死性凋亡相关蛋白（p⁃RIP1、p⁃RIP3、p⁃MLKL）均显著升高，提示Su⁃X可通过诱导肿瘤细胞的坏死性凋亡来抑制肿瘤的发展。从肿瘤治疗的角度来看，进一步加大研究力度以寻求更有效和个体化的治疗极其重要，以往单药治疗肿瘤效果的局限性使得研究和发展联合疗法迫在眉睫。

3 小结

细胞坏死性凋亡作为一种新发现的程序性死亡方式，与多种病例生理过程密切相关，目前坏死性凋亡相关研究多处于基础实验阶段。坏死性凋亡在抗肿瘤方面发挥对立作用，一方面可抑制肿瘤细胞的增殖与迁移；另一方面能够发挥促肿瘤生长的作用，参与肿瘤早期形成。进一步深入研究坏死性凋亡通路的分子机制以及相关信号通路上下游信号分子的关系，探明其在结直肠肿瘤在不同模式中的作用，寻找相应的靶向药物，是未来提高结直肠肿瘤治疗效果的方向之一。