白藜芦醇通过上调SATB2促进HCT 116细胞Bax⁃Caspase3、9凋亡通路蛋白表达

都新新 张文琴 任彩佩 张一楠 孙要军 崔香丽

山西医科大学生理学系（太原030001）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是一种恶性肿瘤，在全世界范围内发病率排名第三，病死率位居世界第二，其中发达国家结直肠癌发病率是发展中国家的三倍。最近十年，结直肠癌的发病率及病死率在包括中国在内的一些发展中国家都呈现上升趋势［1］。早期结直肠癌可以通过手术切除治愈，但仍有复发的风险，而超过50%的病例确诊即为晚期，除需要依靠化疗药物外［2］，手术后并发症和药物的不良反应，也让术后患者生活质量严重下降［3］。因此寻找低毒又有效的预防和治疗方法很有必要。白藜芦醇（resveratrol，Res）是一种天然的具有抗炎、抗癌、抗氧化作用的多酚类化合物，存在于红葡萄等多种植物中。本实验室前期研究表明白藜芦醇通过食物给予可起到预防和治疗肠炎相关结肠癌的作用，白藜芦醇可以促进结肠癌上皮细胞凋亡，但其机制尚不明确［3］。

BCL⁃2家族蛋白（包括Bax、Bcl⁃2等）控制着细胞凋亡的一个关键点，即线粒体外膜通透性，它们能够通过调控关键信号分子如细胞色素c（Cyto⁃chrome C，Cyt⁃C）的释放启动细胞凋亡。Cyt⁃C能促进Caspase⁃3、Caspase⁃9的活化，导致细胞凋亡从而抑制癌症发展［4-8］。

近年来，许多研究发现结直肠癌的发生和发展与某些基因的表达异常有关，例如干扰ZEB1表达可抑制人结直肠癌细胞的增殖、迁移能力，增加细胞凋亡，抑制其上皮间质转化［9］；一种富含AT序列的DNA结合蛋白（SATB2）是一种核基质相关蛋白，在生物发育、基因调控等过程中发挥重要作用，SATB2的异常调控已被发现与各种类型的癌症高度相关［10］。因此本实验选择人结肠上皮细胞系HCT 116细胞作为研究对象，探究白藜芦醇对SATB2蛋白表达的影响以及促进HCT 116细胞凋亡蛋白表达的机制。

1 材料与方法

1.1 材料人结肠癌细胞系HCT 116购自于中国科学院细胞库，白藜芦醇（纯度≥99%）和DMSO购自美国sigma公司，SATB2 siRNA以及SATB2过表达质粒购自锐博生物公司，转染试剂购自QIAGEN公司，Lip2000购自invitrogen公司，SATB2兔单克隆抗体、Bax兔单克隆抗体、Bcl⁃2兔单克隆抗体、Cytochrome C兔单克隆抗体、Caspase⁃9兔单克隆抗体购自美国abcam公司，Caspase⁃3兔多克隆抗体、β⁃actin鼠单克隆抗体、HRP山羊抗鼠IgG二抗购自武汉proteintech公司，HRP山羊抗兔IgG二抗购自北京全式金公司，脱脂奶粉购于CST公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养采用含10%胎牛血清以及含1%双抗的DMEM高糖培养基，于含有5%CO2的37℃恒温培养箱中培养HCT 116细胞，细胞传代一次后，取对数生长阶段的细胞计数，并接种在六孔板上，接种24 h后，分别加入10 mg/mL的白藜芦醇储存液0、2、4、6、8 μL（体系中白藜芦醇终浓度依次为0、8.33、16.67、25、33.33 μg/mL），继续培养48 h后，收集细胞。

1.2.2 细胞转染实验取对数生长期的细胞接种在六孔板上。（1）SATB2敲低实验：将细胞分为control组，si⁃SATB2组，Res组，si⁃SATB2+Res组。si⁃SATB2组 和si⁃SATB2+Res组 进 行 瞬 时 转 染si⁃SATB2，24 h后，Res组、si⁃SATB2+Res组加入10 mg/mL的白藜芦醇2 μL，十字摇匀放入培养箱继续培养48 h。（2）SATB2过表达实验：将细胞分为control组，空质粒组，SATB2过表达组，SATB2过表达+Res组。种板的细胞过夜贴壁后，用Lip2000转染试剂进行质粒转染，转染24 h后，SATB2过表达+Res组加入2 μL 10 mg/mL的白藜芦醇，十字摇匀，放入培养箱继续培养48 h。

1.2.3 Western blot检测蛋白的表达收集培养并转染成功的细胞，加入含有1%PMSF的RIPA裂解液，超声破碎细胞，离心后吸取上清，提取细胞总蛋白，BCA法测定提取的蛋白浓度，加入5X loading buffer和RIPA制备蛋白上样液。制备好的蛋白上样液按照上样量20 μg进行SDS⁃PAGE凝胶电泳，电泳条件250 V，25 min，电泳结束后，室温下半干转法将凝胶上的蛋白转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉（0.25 g脱脂奶粉+5 mL TBST）封闭1.5 h，封闭结束后注入一抗室温孵育1 h，然后4℃过夜，第2天回收一抗，TBST洗膜后室温下二抗孵育1 h，再次TBST洗膜，利用ECL显影液在Chemic⁃DocTMMP中显影，利用Image Lab软件分析蛋白条带灰度值。

1.3 统计学方法采用SPSS 23.0以及Origin 8.0软件进行统计学分析，所有实验结果的数据均重复3次以上，数据以均值±标准差的形式显示，两组之间采用独立样本t检验进行比较分析，多组之间采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Res上调HCT 116细胞SATB2蛋白的表达本实验室前期实验结果显示Res能够上调小鼠结肠组织中miR⁃31的表达，SATB2是miR⁃31作用的直接靶基因，因此本研究对HCT 116细胞给予Res 48 h处理。Western blot结果显示，Res可上调HCT 116细胞中SATB2蛋白的表达（P<0.01），且随着Res浓度升高而变化，Res浓度为8.33 μg/mL时，SATB2蛋白表达量最高，而Res浓度为16.67、25、33.33 μg/mL时，由于药物剂量增加可能带来的非特异性细胞毒性，细胞出现非正常死亡，HCT116细胞SATB2蛋白表达量反而逐渐降低［3］（图1A、2A，表1）。SATB2过表达和敲低实验中，其表达发生了相应的增高和下降，说明实验方法成功。给予Res 8.33 μg/mL处理24 h后，SATB2蛋白比对照组显著升高（P<0.05，图1B、2B，表2）。

2.2 Res可逆转SATB2抑制引起的Bax/Bcl⁃2比值下降为了探究SATB2对HCT 116细胞凋亡水平的作用以及Res对这种作用的影响，使用si⁃SATB2对细胞进行干扰，同时给予Res处理。Western blot结果显示，与Control组相比较，用SATB2⁃siRNA进行干扰后，Bcl⁃2/Bax比值显著升高（P<0.05）；单独Res处理组的Bcl⁃2/Bax比值则显著下降（P<0.05）；而SATB2⁃siRNA进行干扰并给予Res处理组的Bcl⁃2/Bax比值则差异无统计学意义（P<0.05）。说明抑制SATB2基因表达可抑制Bax表达，促进Bcl⁃2表达，导致Bcl⁃2/Bax比值上升，减少肠上皮细胞凋亡，而Res可以逆转此作用。见图2、表3。

图1 HCT 116细胞SATB2蛋白的表达Fig.1 Relative expression of SATB2 in HCT 116 cells

图2 不同浓度Res对SATB2蛋白表达的影响Fig.2 The effects of Res concentration on SATB2 expression

表1 不同浓度Res作用后SATB2表达Tab.1 Relative expression of SATB2 in HCT 116 cells after treat with different concentrations of resveratrol±s

表1 不同浓度Res作用后SATB2表达Tab.1 Relative expression of SATB2 in HCT 116 cells after treat with different concentrations of resveratrol±s

注：与Control组比较，**P<0.01；Res2组比较，##P<0.01

组别 例数SATB2 Control3 0.168 8±0.074 9 Res23 0.500 7±0.029 8**Res4 Res6 Res83 3 3 0.235 9±0.013 2##0.194 6±0,055 7##0.125 5±0.034 3##

表2 不同处理对SATB2表达的影响Tab.2 Relative expression of SATB2 in HCT 116 cells after SATB2 overexpression，knock⁃down in presence of resveratrol x±s

将SATB2过表达质粒转入HCT116细胞后，同时给予Res处理，Western blot结果显示，与Control组相比较，转染空质粒组的Bcl⁃2/Bax比值并无显著差异；转染SATB2过表达质粒组Bcl⁃2/Bax比值下降（P<0.05）；而转染SATB2过表达质粒同时给予Res处理组的Bcl⁃2/Bax比值下降更为显著（P<0.05）。表明SATB2能够促进Bax表达并且抑制Bcl⁃2表达，导致Bcl⁃2/Bax比值下降，Res则能够加强这种作用，与Res增加SATB表达结果一致。见图3，表3。

图3 敲低SATB2同时给予Res处理后的Bax和Bcl⁃2蛋白表达Fig.3 Relative expression of Bax and Bcl⁃2 in HCT 116 cells after SATB2 knock⁃down in presence of resveratrol

图4 过表达SATB2同时给予Res处理后的Bax和Bcl⁃2蛋白表达Fig.4 Relative expression of Bax and Bcl⁃2 in HCT 116 cells after SATB2 overexpression in presence of resveratrol

表3 敲低或过表达SATB2同时给予Res处理后Bcl⁃2/Bax比值的变化Tab.3 Relative expression of Bcl⁃2/Bax Ratio in HCT 116 cells after SATB2 overexpression，knock⁃down in presence of resveratrol

2.3 Res激活Bax/Bcl⁃2/Cyt⁃C/Caspase3、9凋亡通路促进HCT 116细胞凋亡为了研究Res通过SATB2调控HCT 116细胞凋亡的机制，采用Western blot检测转染SATB2⁃siRNA以及SATB2过表达质粒同时给予Res处理的相关通路蛋白表达水平。结果显示，与Control组相比较，转染SATB2⁃siRNA后，HCT 116细胞的细胞色素C（Cyt⁃C）表达水平下降（P<0.01）；单独给予Res处理组的Cyt⁃C表达水平则显著升高（P<0.05）；而转染SATB2⁃siRNA同时给予Res处理组的Cyt⁃C表达水平则与Control组差异无统计学意义（P<0.05，图5A，表4）。此外检测位于细胞凋亡通路下游的Caspase⁃3、Caspase⁃9蛋白的表达结果显示，与Control组相比较，转染SATB2⁃siRNA后，细胞的Caspase⁃3、Caspase⁃9蛋白表达水平均显著下降（P<0.05）；单独给予Res处理组的Caspase⁃3、Caspase⁃9蛋白表达水平则显著升高（P<0.05）；而转染SATB2⁃siRNA同时给予Res处理 组的Caspase⁃3、Caspase⁃9蛋 白 表达水平则差异无统计学意义（P<0.05，图5B、C，表4）。以上结果表明抑制SATB2基因表达可抑制Cyt⁃C、Caspase⁃3、Caspase⁃9蛋白的表达、抑制HCT 116细胞凋亡，而Res可以逆转此作用。

表4 敲低SATB2同时给予Res处理后的Cyt⁃C、Caspase⁃3、Caspase⁃9蛋白表达Tab.4 Relative expression of Cyt⁃C，Caspase⁃3，Caspase⁃9 in HCT 116 cells after SATB2 knock⁃down in presence of resveratrol

研究各组细胞蛋白表达水平在SATB2过表达情况下的差异Western blot结果显示，与Control组相比较，转染空质粒组的Cyt⁃C、Caspase⁃3、Caspase⁃9表达水平差异无统计学意义；转染SATB2过表达质粒组Cyt⁃C（P<0.01）、Caspase⁃3（P<0.05）、Cas⁃pase⁃9（P<0.05）表达水平明显升高；而转染SATB2过表达质粒同时给予Res处理组的Cyt⁃C（P<0.05）、Caspase⁃3（P<0.05）、Caspase⁃9（P<0.01）表达水平升高更为显著。表明SATB2能够促进Cyt⁃C、Caspase⁃3、Caspase⁃9蛋白的表达，Res则可加强这种作用。见图6，表5。

图5 敲低SATB2同时给予Res处理后的Cyt⁃C、Caspase⁃3、Caspase⁃9蛋白表达Fig.5 Relative expression of Cyt⁃C，Caspase⁃3，Caspase⁃9 in HCT 116 cells after SATB2 knock⁃downin presence of resveratrol

图6 过表达SATB2同时给予Res处理后的Cyt⁃C、Caspase⁃3、Caspase⁃9蛋白表达Fig.6 Relative expression of Cyt⁃C，Caspase⁃3，Caspase⁃9 in HCT 116 cells after SATB2 overexpression in presence of resveratrol

3 讨论

白藜芦醇是一种在红葡萄果皮中含量丰富的植物天然合成的非类黄酮多酚类物质，同时也是一种植物抗毒素，具有抗氧化特性［11］。早在21世纪初，就有研究报道白藜芦醇对心血管系统具有保护作用，有助于控制动脉粥样硬化、心脏病、关节炎和自身免疫性疾病。临床试验证明，白藜芦醇在胃肠道中会被迅速吸收，继而迅速代谢为葡萄糖醛酸苷和硫酸盐，导致组织和血浆中白藜芦醇浓度较低，但在对结直肠癌的研究中发现，低剂量的白藜芦醇对结直肠癌仍有很好的效果［11-13］。白藜芦醇能够减轻结肠炎小鼠的炎症症状，下调相关炎症标志物的表达［14］。

表5 过表达SATB2同时给予Res处理后的Cyt⁃C、Caspase⁃3、Caspase⁃9蛋白表达Tab.5 Relative expression of SATB2 in HCT 116 cells after SATB2 overexpression in presence of resveratrol ±s

表5 过表达SATB2同时给予Res处理后的Cyt⁃C、Caspase⁃3、Caspase⁃9蛋白表达Tab.5 Relative expression of SATB2 in HCT 116 cells after SATB2 overexpression in presence of resveratrol ±s

注：与Control组比较，*P<0.05，**P<0.01

组别Control pEXP⁃RB⁃Mam pEXP⁃RB⁃Mam⁃SATB2 pEXP⁃RB⁃Mam⁃SATB2+Res例数3 3 3 3 Cyt⁃C 0.472 4±0.098 5 0.485 1±0.070 9 0.973 2±0.103 1**1.352 6±0.431 6*例数3 3 3 3 Caspase⁃3 0.190 8±0.005 7 0.199 1±0.015 6 0.337 4±0.081 2*0.363 5±0.097 0*例数6 6 6 6 Caspase⁃9 0.396 7±0.006 5 0.418 4±0.006 5 0.704 7±0.120 1*0.793 6±0.099 9**

恶性肿瘤的发生具有异质性，炎症、氧化应激和细胞凋亡等多种机制都可能参与了其发生和发展。而白藜芦醇预防和治疗动物肠炎相关肠癌的作用机制包括抗氧化、抗炎、诱导细胞凋亡和抗血管生成等作用［15］。有研究报道白藜芦醇单独或联合用药也能有效抑制HCT 116细胞中NF⁃κB信号通路，从而抑制癌细胞转移达到抗结直肠癌的作用［16］。白藜芦醇通过多种途径抑制肿瘤，例如肖忠盛等［17］证实白藜芦醇通过下调mTOR信号通路抑制结直肠癌细胞的增殖；白藜芦醇可通过线粒体途径促进人体鳞癌细胞凋亡，上调促凋亡蛋白Bax，下调抗凋亡蛋白Bcl⁃2，从而使细胞色素c从线粒体释放到胞质当中，Caspase⁃9、Casapase⁃3被激活［18-20］，可有效抑制小鼠结肠肿瘤的产生［21］。本研究结果显示经白藜芦醇处理的HCT 116细胞，细胞色素c的表达量明显上升，上游的Bax、Bcl⁃2蛋白以及下游的Caspase⁃3、9蛋白都相应发生变化，提示白藜芦醇促进HCT116细胞凋亡的作用与Bax/Bcl⁃2/Cyt⁃C/Caspase3、9凋亡通路的激活有关。

作为一种潜在的抗肿瘤药物，白藜芦醇抗肿瘤作用的分子机制一直是研究的热点。SATB2在许多类型的癌症中都有异常转录，并且在不同的类型的细胞中，SATB2既可能是肿瘤抑制因子也可能是肿瘤促进因子。同时，SATB2也受很多分子的调控，如miR⁃31和miR⁃34a［10，22-24］。本研究结果证实白藜芦醇对HCT 116细胞SATB2蛋白表达的上调作用。在敲低和过表达SATB2基因的情况下，观察白藜芦醇对HCT 116细胞经线粒体途径凋亡作用的影响。结果显示敲低SATB2后，HCT 116细胞中Bax/Bcl⁃2/Cyt⁃C/Caspase3、9凋亡通路各蛋白表达量下降，而白藜芦醇可以一定程度的逆转此作用；过表达SATB后，Bax/Bcl⁃2/Cyt⁃C/Caspase3、9凋亡通路蛋白表达上调，白藜芦醇则能加强这种作用；表明白藜芦醇促进Bax/Bcl⁃2/Cyt⁃C/Caspase3、9凋亡通路的作用与上调SATB2蛋白的表达有关。

综上所述，本研究证实了白藜芦醇能够通过Bax/Bcl⁃2/Cyt⁃C/Caspase3、9凋亡通路促进HCT 116细胞凋亡，同时也能上调SATB2的表达。过表达SATB2基因能够上调HCT 116细胞中Bax/Bcl⁃2/Cyt⁃C/Caspase3、9凋亡通路，表明白藜芦醇促进HCT 116细胞经Bax/Bcl⁃2/Cyt⁃C/Caspase3、9途径凋亡的作用与上调SATB2表达有关，为白藜芦醇抗结直肠癌机制的研究提供了新的思路，但关于白藜芦醇如何作用于SATB2以及SATB2影响凋亡通路的具体机制仍需进一步研究。