曼地亚红豆杉精油组分及其抑菌活性研究

徐 迪，苏 超，张 洋

(芜湖职业技术学院生物工程学院，安徽芜湖 241000)

0 引言

食物在储存过程中经常容易被微生物污染.为了确保食物的安全，人们需要采取有效的抑菌、抑霉菌毒素和抗氧化措施.众所周知，化学合成的食品防腐剂对消费者和环境具有有害影响，而含有挥发性成分的各种植物精油具有较强的抗菌和抗氧化活力[1].目前已有一些植物精油由于其良好的抑菌效果及安全性，被加工成食品熏蒸剂，用于降低食品贮藏过程中的污染损失及延长食品的货架期[2].

曼地亚红豆杉(TaxusmediaRehder)是1918年美国学者发现的由母本东北红豆杉(Taxuscuspidata)和父本欧洲红豆杉(Taxusbaccata)自然杂交得到的品种[3]，现在被广泛用于水土保持、环境改善与园林美观等.其树皮和枝叶中含有丰富的天然抗癌物质紫杉醇，对CCl4诱导的大鼠肝纤维化有抑制作用[3-4].此外，红豆杉枝叶中还含有大量芳香性挥发油、生物黄酮、鞣质、植物酵素和前青花素等抗氧化剂类物质[5-6].本研究从曼地亚红豆杉中提取分离精油并进行组分分析鉴定，对其抑菌活性展开研究，以期为曼地亚红豆杉植物资源的有效开发利用提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

曼地亚红豆杉：购自安徽金寨县天堂寨天马红豆杉科技有限公司；供试菌种：购于中国科学院微生物菌种保藏中心；欧莱博HH-4数显恒温水浴锅(山东博科科学仪器有限公司)；数显控温不锈钢DB-2A电热板(常州市仪都仪器有限公司)；FK-A组织捣碎机(金坛市精达仪器制造有限公司)，挥发油提取器(扬州沪武教学设备有限公司)；GC-MS(HP 5890 II 型气相色谱仪，5972质谱仪，安捷伦公司).

1.2 试验方法

1.2.1 精油提取 参考文献[7]，采用水蒸气蒸馏提取法进行精油的提取.取去杂新鲜曼地亚红豆杉嫩叶1 000 g，用粉碎机粉碎；将原料粉末与30 g食盐搅拌均匀后装入蒸馏瓶中，通入蒸气蒸馏处理2.5 h；收集油水混合物，20 000 r/min，离心10 min，收集上层油相，计算精油得率(图1).

图1 曼地亚红豆杉精油的提取工艺流程Fig.1 Extraction process of essential oil from Taxus media

1.2.2 精油成分鉴定 精油的组成成分采用HP 5890 II 型气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)进行鉴定[8-9].色谱条件：毛细管色谱柱30 m×0.32 mm，0.25 μm；初始温度60 ℃，保持10 min，以4 ℃/min升至220 ℃并保持10 min，之后以1 ℃/min升至240 ℃并保持5 min；载气为氦气，流量1 mL/min；样品用1:1(体积比)乙醚稀释，进样体积2 μL；电离方式为电子轰击(EI)，电子能量为70 eV；离子源温度为200 ℃；扫描范围为35～450 u.

1.2.3 抑菌活性分析 供试菌种包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，两种革兰氏阳性菌；大肠杆菌(Escherichiacoli)，普通变形杆菌(Proteusvulgaris)两种革兰氏阴性菌；以及酵母菌(Rhodotorulaglutinis)和黄曲霉菌(Aspergillusflavus)两种特殊的真菌.四种细菌选用营养琼脂培养基，两种真菌选用马铃薯葡萄糖琼脂培养基.采用纸片扩散法和琼脂稀释法[10]对曼地亚红豆杉精油的抑菌活性进行测定，以庆大霉素(20 μg/mL)和两性霉素(80 μg/mL)分别作为细菌和真菌抑菌活性的阳性对照.

纸片扩散法分析精油的抑菌活性：经过培养，使菌落平板或液体培养基中微生物的浓度达到107CFU/mL或108孢子/mL，将4 μL精油装入直径为6 mm的滤纸片，然后将滤纸片放在凝胶琼脂板上，6种细菌在(37±1)℃培养24 h，酵母菌在(28±1)℃培养48 h，黄曲霉菌在(25±1 )℃培养7 d，观察并记录抑菌圈直径(DD).

琼脂稀释法分析精油的抑菌活性：无菌环境中将4 mL吐温80溶液和1 mL精油混合并剧烈搅拌2 min使精油均匀分散，将母液浓度从100 μg/mL浓缩至500 μg/mL，并倒入培养皿中，细菌在(37±1)℃培养24 h，酵母菌在(28±1) ℃培养48 h，黄曲霉菌在(25±1)℃培养7 d，以培养皿中不长菌时的精油质量浓度，确定为精油抑菌的最低质量浓度(MIC).

1.2.4 统计分析 结果用平均值±标准差表示.运用SPSS 11.5软件进行统计和单因素方差分析，P<0.05表示差异显著.

2 结果与分析

2.1 精油中的化学成分

用水蒸气蒸馏法提取曼地亚红豆杉中的精油，精油提取率为新鲜样品重量的0.31%.用GC-MS气相色谱质谱仪进行分析(图2)，通过仪器配备的计算机谱库检索并与标准质谱图对照，鉴定出了30种化合物，占精油混合物成分中的97.14%(表1)，主要化合物为顺式-3-己烯-1-醇(29.42%)、3，3-二甲基酸(18.13%)、戊乙烯甲醇 (15.61%)、4-羟基-2-对甲基苯乙酮(6.02%)、蒎烯-2-酮-4马鞭草烯酮(5.03%)、3，5-二甲氧基苯酚(4.34%)、1-己醇(1.98%)、香桃木醇(1.34%)、萜品醇(1.26%)、辛基乙醇(1.12%)、安息香醛(1.10%)、橙花基乙醇(1.04%).检测出的化合物中含量从大到小依次为醇类(61.37%)，酸类(18.54%)，酮类(7.84%)，腈类(4.34%)，酯类(2.18%)，醛类(1.10%)，烷烃类(0.98%)，烯烃类占(0.79%)(表2)[11].目前只有6篇是关于红豆杉中提取精油的文献记载[6].与王艇[12]、Merajuddin[13]和Radulovic[14]等人的报道相比，本次研究结果发现的精油化合物成分及其百分比均有明显的不同，而Dragoljub[11]等人发现的主要成分是棕榈酸(35.66%)、9-十六碳烯酸9-十六碳烯酯(11.28%)、3-辛醇(4.47%)、1-苯-1,2-丙二酮(4.3%)、N-苯基-1-萘胺(3.57%)、1,2-苯二羧酸(2-甲基丙基)二酯(3.57%)、6,10-二甲基-5,9-十一双烯-2-酮(3.24%)、3,7-二甲基-1-辛烯-3-醇(3.08%)、苯甲醛(2.31%)等.其中14,17-环二氧-28-r-15-蒲公英赛烯-2,3-二醇化合物只在这次研究中被发现，这很有可能是由于植物生长所处的地理位置和环境的变化所导致.

图2 曼地亚红豆杉精油GC-MS总离子流色谱图Fig.2 GC-MS chromatogram of total ion flow of essential oil from Taxus media

表1 曼地亚红豆杉精油的化学成分与含量Tab.1 Main chemical composition of Taxus media essential oil

表2 曼地亚红豆杉精油中化合物主要类别及百分比Tab.2 Composition of the essential oil of Taxus media by chemical class

2.2 抑菌活性

红豆杉精油的抑菌效果取决于它的有效化学成分.曼地亚红豆杉精油的抑菌活性如表3所示.从纸片扩散法的结果中可以得出，该精油具有很强的抑菌能力，且对细菌的抑制效果要好于真菌.数据显示，供试菌中大肠杆菌对精油最敏感，其抑菌圈直径最大(27 mm)；酵母菌对精油最不敏感，其抑菌圈直径最小(15 mm).对细菌而言，挥发油对G+菌和G-菌的抑制圈直径分别为20～23 mm和25～27 mm.相比之下，真菌对精油的抵抗性要高于细菌，酵母菌对精油较为敏感.从表3可见，金黄色葡萄球菌的MIC最低(137.16 μg/mL)，酵母菌的MIC最高(168.1 μg/mL).

表3 曼地亚红豆杉精油的抑菌活性Tab.3 Antimicrobial activities of Taxus media essential oil by the diameter inhibition zones and MIC method

总体来说，曼地亚红豆杉精油具有很好的抑菌活性且对细菌的抑制效果要强于真菌，这可能是因为精油中有顺式-3-己烯-1-醇、戊乙烯甲醇、14,17-环二氧-28-r-15-蒲公英赛烯-2,3-二醇、苯甲醛等[15]物质.已有报道[16]，顺式-3-己烯-1-醇，戊乙烯甲醇对于植物生长过程中起重要保护作用，能有效抑制受伤区域引起细菌增殖.Tresvenzol等[17]研究证明了苯甲醛对多种微生物均具有良好的抑制效果.曼地亚红豆杉精油的抑菌活性可能是由于多种化合物的协同作用[18].随着人们对芳香疗法的青睐，物美价廉的曼地亚红豆杉精油将是一种新型抗菌精油的潜在来源[19].

nd: 未检出；DDa:抑菌圈直径(mm)；MICb:最低抑菌质量浓度(μg/mL).

3 结论与讨论

用水蒸气蒸馏提取法从曼地亚红豆杉中提取精油，运用GC-MS对其进行分析鉴定，用纸片扩散法和琼脂稀释法对精油的抑菌活性进行测定.得到实验结果为：精油得率为0.31%，共鉴定出30种化合物，主要化合物为顺式-3-己烯-1-醇(29.42%)，3,3-二甲基酸(18.13%)，戊乙烯甲醇 (15.61%).通过抑菌圈直径和最低抑菌质量浓度的测定证实了曼地亚红豆杉精油对常见腐败微生物具有较高的抑菌活性，且对细菌的抑制效果高于真菌.与已报道的白豆杉叶的精油成分[20]和南方红豆杉叶的精油成分[12]相比较，曼地亚红豆杉精油与其相同成分不多，这可能有助于我们了解红豆杉科内各属间系统关系.总的来说，具有良好抑菌活性和愉悦香味的曼地亚红豆杉精油在食品工业和化妆品工业的应用及潜在价值将会受到人们极大的关注.