TLR2、IL-10 mRNA的表达及树突状细胞分布在外阴硬化性苔藓中的临床意义①

王楠楠 王 婧 刘嗣同 武 昕（中国医科大学附属第一医院妇科，沈阳 110000）

外阴硬化性苔藓（vulvar sclerosing lichen，VLS）是妇科常见的一种慢性难治性疾病，表现为女性外阴瘙痒、皮肤色素脱失、萎缩，严重者出现尿道口和阴道口狭窄，恶变率为2%～4%［1］。目前病因和发病机制尚不清楚，可能与自身免疫、感染、性激素和遗传有关，也没有较好的治疗方法。因此，探讨VLS发病机制是临床上亟待解决的问题。因其真皮内可见大量的淋巴细胞和浆细胞浸润，故多数学者认为它是一种与自身免疫有关的疾病［1］。前期研究发现VLS中促炎因子干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α和白介素-1，2等明显增多，而抗炎因子研究较少（IL-10）在VLS中表达情况尚未见报道［2-3］。Toll样受体（TLR）是连接固有免疫与适应性免疫的桥梁，TLR广泛分布于多种细胞表面，其中TLR-2表达范围最广，TLR-2主要存在淋巴细胞、浆细胞和树突状细胞表面，TLR-2通过影响T辅助细胞1（T helper cell1，Th1）和T辅助细胞2（T helper cell 2，Th2）的平衡，引起IFN-γ分泌降低，IL-10分泌相对升高，来抑制免疫反应［4-5］。前期本课题组检测到淋巴细胞CD4、CD8在VLS中真皮层明显增多，而树突状细胞在VLS形成和发展作用如何？TLR2和IL-10是否表达异常，与病变关系如何？目前尚不清楚，因此，本研究探讨TLR2、IL-10 mRNA和树突状细胞在VLS病变形成中作用。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 选取2016至2018年在中国医科大学附属第一医院妇科手术或活检的VLS标本50例（早期和进展期各25例），外阴正常皮肤（源于外阴整形手术切除的正常组织）15例。部分福尔马林溶液固定用于免疫组化实验；部分新鲜标本-80℃保存，用于PCR实验。所有标本诊断均经2位病理医生证实。本研究已通过中国医科大学附属第一医院伦理委员会审查。

1.1.2 主要试剂 鼠抗人CD1α单克隆抗体、通用S-P超敏试剂盒（福州迈新生物技术有限公司）；miRNeasy Mini Kit试剂盒（德国Qiagen公司）；β-actin、IL-10、TLR2引物（美国Invitrogen公司）；A5001反转录试剂盒及A6001 Real Time PCR试剂盒（美国Pro‑mega公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化检测4µm石蜡切片，脱蜡至水，枸橼酸缓冲液热抗原修复，采用免疫组织化学S-P法对CD1α细胞进行染色。滴加过氧化物酶阻断溶液（试剂A）室温下孵育10 min，正常非免疫动物血清（试剂B）室温下孵育20 min，再加一抗（CD1α单抗1∶100），37℃孵育1 h，生物素标记的二抗（试剂C）室温下孵育30 min，链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液（试剂D）室温下孵育30 min，DAB呈色后苏木素复染。以PBS代替一抗作阴性对照。切片脱水后封片保存。

1.2.2 PCR检测

1.2.2.1 总RNA的提取 使用miRneasy Mini Kit试剂盒抽提全部30例标本组织RNA，操作按说明书进行，RNA样品保存于-80℃冰箱。

1.2.2.2 RNA的逆转录 ①取一定量模板RNA加入引物。②模板RNA与引物的混合物，70℃、5 min预变性，完成后取出置于冰上。③配置RT-Mix，向每个样品管加入10µl RT-Mix，见表1。④设置反转录程序，包括退火（25℃，5 min）、延伸（42℃，60 min）、逆转录酶失活（70℃，15 min）三步。程序完成后得到cDNA，并存于-20℃冰箱，（按照promega A5001试剂说明书操作）。

表1 RT-Mix具体配置方法Tab.1 Specific configuration method of RT-Mix

1.2.2.3 RT-PCR（按照promega A6001试剂说明书操作）①按表2配置PCR反应混合液，并分至各反应管，然后加入2µl模板。②反应体系加入96孔板，加盖光学封口膜，离心后放入ABI 7900HT荧光定量PCR仪，PCR反应条件为：95℃2 min，95℃15 s，60℃60 s，40个循环，实验重复3次。③完成RTPCR后对其溶解曲线进行分析，并结合琼脂糖分析PCR产物是否特异。分析PCR反应曲线，所得出的数据按2-ΔΔCT法计算出基因表达的相对量。本实验涉及的引物，β-actin由Invitrogen公司设计，具体引物如下，见表3。

表2 PCR反应混合液具体配置方法Tab.2 Specific configuration method of PCR reaction mixture

表3 引物列表Tab.3 List of primers

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0版软件进行统计数据的分析，实验数据用±s表示，统计学方法采用t检验，P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 CD1α阳性细胞在VLS中的表达CD1α阳性细胞光镜下：在正常皮肤中平均（14.0±5.8）个，在早期VLS中平均（18.4±7.7）个，两者无统计学上差异（P＞0.05）。在进展期VLS中平均（28.6±3.2）个，与正常相比有统计学意义（P＜0.05）。见表4、图1。

表4 CD1α阳性细胞在VLS中的表达（±s）Tab.4 Expression of CD1αpositive cells in VLS（±s）

表4 CD1α阳性细胞在VLS中的表达（±s）Tab.4 Expression of CD1αpositive cells in VLS（±s）

Note：Compared with healthy vulvar skin，1）P＜0.05.

Number 14.0±5.8 18.4±7.7 28.6±3.21）Groups Healthy vulvar skin Early VLS Advanced VLS n 15 25 25

图1 CD1α阳性细胞在VLS中的表达Fig.1 Expression of CD1α-positive cells in VLS

2.2 TLR2、IL-10 mRNA在VLS中的表达TLR2的mRNA表达量在早期VLS为1.34±1.27，与正常皮肤（1.65±0.84）相比无统计学上差异（P＞0.05）。但在进展期为3.97±0.79，与正常相比有统计学意义上的差异（P＜0.05）。IL-10的mRNA表达量在早期VLS中为1.09±0.89，与正常皮肤（1.08±0.36）相比无统计学上差异（P＞0.05）。在进展期VLS为2.93±1.04，与正常相比有统计学意义上的差异（P＜0.05，见表5）。

表5 TLR2和IL-10 mRNA的相对表达量（±s）Tab.5 Relative expressions levels of TLR2 and IL-10 mRNA（±s）

表5 TLR2和IL-10 mRNA的相对表达量（±s）Tab.5 Relative expressions levels of TLR2 and IL-10 mRNA（±s）

Note：Compared with healthy vulvar skin，1）P＜0.05.

IL-10 1.08±0.36 1.09±0.89 2.93±1.041）Groups Healthy vulvar skin Early VLS Advanced VLS TLR2 1.65±0.84 1.34±1.27 3.97±0.79

3 讨论

目前病理学上将VLS分为两种类型：早期和进展期。早期可见棘层轻度不规则的增厚，真皮浅层水肿，大量的淋巴细胞浸润，无明显的均质带；进展期可见表皮角质层增厚，棘层细胞减少，基底细胞液化，真皮浅层胶原纤维变性形成均质带，其下伴有大量的淋巴细胞和浆细胞浸润［6］。两种病理改变是否存在一个演变的过程，形成机制是否相同，尚不清楚。TLR属于广泛模式识别受体，是连接固有免疫与适应性免疫的桥梁。TLR广泛分布于多种细胞表面，但主要表达于和宿主防御功能有关的细胞，如单核巨噬细胞、粒细胞、树突状细胞、淋巴细胞等。TLR识别内外源性配体后可激活多种信号转导途径，促进细胞因子产生，调节机体免疫应答［7］。TLR中TLR2表达范围最广，其胞外段可识别病原危险相关分子模式（PAMPS/DAMPS）分子。通过跨膜结构将信号转入细胞内，经由髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依赖信号传导途径和MyD88非依赖信号转导途径产生复杂的级联信号反应导致核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）等转录因子活化，介导细胞因子的分泌，参与免疫调节和诱导后天免疫功能的启动。TLR2通过影响Th1和Th2的平衡，引起INFγ分泌的降低，IL-10分泌的相对升高，来抑制免疫反应［4］。激活TLR-2可以促进T细胞产生TLR-2依赖的IL-10，并促进Treg细胞生成［8］。文献报道TLR2/TLR1异质二聚体是CD4+T细胞上的一种协同调控受体，在本课题组前期实验中已检测出CD45RO+T细胞（记忆性CD4+T细胞）在VLS中表达增加，且进展期增加更明显［7］。提示增多的CD4+T细胞表面的TLR2可能也增加，导致IL-10分泌增多。本研究的结果显示VLS早期TLR2和IL-10 mRNA表达略增加，与正常外阴皮肤相比无统计学上的差异；而进展期TLR2和IL-10 mRNA表达明显高于正常，有统计学上差异。提示进展期TLR2和IL-10 mRNA增加与CD4+T细胞增加有一定相关性。树突状细胞是皮肤中一种抗原提呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节，可通过TLR-2通路被激活，从而释放一些细胞因子如IL-10和TGF-β等。活化的树突状细胞极化Th0细胞至Treg细胞，显示树突状细胞中TLR-2依赖的免疫调节功能［9］。本研究发现CD1α标记的树突状细胞在VLS中表达增加，早期没有统计学上差异，进展期增加明显，有统计学意义。与TLR2和IL-10 mRNA在VLS中表达增加呈正相关，进一步证实进展期TLR2和IL-10 mRNA增加与树突状细胞增多有一定的相关性。还有文献报道：TLR2与巨噬细胞的结合被发现可以介导IL-10的产生［9］。本课题组前期实验中还检测到VLS中CD68+细胞（巨噬细胞）增多，进展期增加更明显，与早期相比有统计学上的差异［8］。本研究中TLR2和IL-10 mRNA在进展期也增高，进一步提示TLR2和IL-10 mRNA增加与巨噬细胞增多有一定相关性。综上所述，在VLS进展期CD4淋巴细胞、树突状细胞和巨噬细胞的增加，可能促使其表面活化的TLR2增多，因此，以上细胞产生的IL-10增加。IL-10是体内重要的炎症反应抑制因子，通过下调TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-γ等细胞因子及单核巨噬细胞上MHCⅡ类分子的表达，控制炎症反应的强度及抑制免疫反应［10-11］。IL-10是CD4+CD25+Treg细胞的重要免疫调节因子，诱导CD4+CD25+Treg细胞增多，抑制免疫反应，在VLS的早期IL-10无明显增加，而进展期IL-10明显增多，与TLR2及其相关细胞增多有相关性［12］。进一步提示在VLS进展期存在免疫抑制现象。