人乳腺珠蛋白荧光免疫层析检测方法的建立①

崔云会 陈 楠 王云龙 明 亮 李玉林 王继创

（郑州大学第一附属医院检验科，郑州 450052）

乳腺癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，近年来在全球范围内发病率呈上升趋势［1］。生物标记物的使用已经成为帮助乳腺癌诊断以及确定预后、预测治疗反应和治疗后监测的一种方法，非侵入性的生物标记物，如血清学分子，与其他类型的生物标记物相比，检测更方便［2-3］。人乳腺珠蛋白（human mamma‑globin，hMAM）是子宫珠蛋白基因家族中的一个乳腺特异性成员，编码定位于染色体11q13上的10kDa糖蛋白［4］。hMAM在乳腺上皮细胞中低表达，在乳腺癌中高表达，已被证明与肿瘤早期发现转移有关［5］。且有研究表明，血液中的hMAM可作为乳腺癌的一个独立预后标志物，并且已成为乳腺癌微转移检测的最特异的标志物之一［6］。本研究以镧系稀土元素Eu3+羧基荧光微球作为标记物，建立hMAM时间分辨荧光免疫层析检测方法，为乳腺癌诊断和治疗监测提供一种快捷、准确且经济的方法。

1 材料与方法

1.1 材料SCGB2A2单克隆抗体购自Abnova公司，Eu3+羧基荧光微球购自Bangs公司，羊抗鼠IgG、hMAM多抗、hMAM室内参考品均由河南省生物工程技术研究中心提供，PVC板购自上海良信公司，硝酸纤维素膜（NC膜）购自Sartorius公司，玻璃纤维棉购自上海金标生物科技有限公司，Human mam‑maglobin ELISA试剂盒购自Cusabio公司，临床样本由郑州大学第一附属医院提供，其他化学试剂均为分析纯。免疫荧光定量检测仪购自杭州峰航科技有限公司，XYZ三维点膜喷金仪、微电脑自动斩切机购自上海金标生物科技有限公司，超微量紫外分光光度计购自Thermo fisher公司，超声波细胞粉碎机购自宁波新芝生物科技股份有限公司，纳米粒度电位仪购自Malvern公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫微球制备 采用EDC（1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺）和NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）化学偶联的方法活化微球，取50µl荧光微球加入1 ml 20 mmol/L MES溶液，漩涡振荡混匀后，加入20µl EDC溶液（10 mg/ml）和200µl NHS溶液（20 mg/ml）作为活化剂混匀后，低速摇床振荡活化1 h；15 000 r/min离心15 min，弃上清，加入1 ml0 mmol/L MES，沉淀用500µl MES（20 mmol/L）旋起，超声分散；再加入10µg hMAM标记抗体，偶联2 h；15 000 r/min离心15 min，弃上清，加入1 ml封闭液，超声后摇床振荡2 h；加入微球保护液500µl复溶沉淀，超声后备用，并用粒度仪检测偶联抗体后的标记微球与纯净微球粒径大小均一性。

1.2.2 试纸条构建 用XYZ三维点膜喷金仪将1.0 mg/ml的hMAM包被抗体、2.0 mg/ml羊 抗 鼠IgG以1µl/cm的量包被于NC膜上，分别作为检测线T线、质控C线，并于37℃干燥2 h。将1.2.1制备好的微球混匀后，按8µl/cm均匀喷在微球垫上，置于37℃干燥2 h；依次将样品垫、微球垫、包被有T线、C线的NC膜和吸水纸组装在PVC板上，用自动斩切机裁成3.9 cm宽的试纸条。

1.2.3 试纸条检测 在样品垫上滴加70µl样品，10 min后放置于免疫荧光定量检测仪上检测，通过T线、C线荧光强度分析样品中的hMAM浓度。

1.2.4 工艺条件优化 在实验室前期研究基础上，设计四因素三水平正交实验确定最优的MES缓冲液量、荧光微球量、超声功率、超声时间，选择20 mmol/L MES缓冲液量为500、1 000、1 500µl，微球量为40、50、60µl，超声功率为60、80、100 W，超声时间0.5、1、2 min，按照1.2.1、1.2.2的工艺流程制备试纸条。

1.2.5 分析性能评价

1.2.5.1 建立标准曲线 取浓度为0.312、0.625、1.25、2.5、5、10、20 ng/ml的hMAM线性标准品，重复检测3次，以hMAM浓度为横坐标，相应的T/C均值为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.5.2 精密性 随机抽取3批试纸条，分别检测低、中、高值的hMAM样本，每个浓度重复测定10次，分析3个批次批内和批间变异系数（CV）。

1.2.5.3 准确度 用基质血清将20 ng/ml的hMAM室内质控品稀释成预测浓度为3、10、17 ng/ml样品，采用本方法制备的hMAM免疫层析试纸条检测，分别计算其回收率，回收率=（实测浓度/预测浓度）×100%。

1.2.5.4 特异性 将CEA（20 ng/ml）与CA153（50 U/ml）分别与浓度为15 ng/ml的hMAM室内质控品等体积混合后，重复检测10次。

1.3 方法学比对 应用本研究建立的hMAM荧光免疫层析试纸条与CUSABIO公司Human Mamma‑globin ELISA试剂盒平行检测46例乳腺癌样本的外周血中hMAM的含量，并进行相关性分析。

2 结果

2.1 免疫微球制备 采用荧光层析工艺进行微球与抗体偶联，偶联微球与纯净微球粒径检测结果如图1所示：均为单一峰，且偶联前后粒子分布均一性较好（PDI＜0.20），说明采用本实验方法偶联微球效果较好。

图1 标记微球与纯净微球粒径强度与体积分布Fig.1 Particle size intensity and volume distribution of la-beled microspheres and pure microspheres

2.2 工艺条件优化 四因素三水平正交实验结果如表1所示：由极差分析可得，最优组合为MES缓冲液量1 000µl、微球50µl、超声功率100 W、超声时间1 min。

表1 四因素三水平实验结果Tab.1 Four-factor three-level experimental results

2.3 分析性能评价

2.3.1 标准曲线的建立 本实验建立的荧光层析方法检测结果如图2所示：y=0.177x+0.097，R2=0.992 3。线性范围为0.312～20 ng/ml。

图2 荧光免疫层析法检测人乳腺珠蛋白标准曲线Fig.2 Standard curve of mammoglobin detection by fluo-rescence chromatography

2.3.2 精密性 采用本方法制备的试纸条检测浓度分别为3、10、17 ng/ml的样品，批内变异系数分别为7.65%、8.74%、8.97%，均小于10%；批间变异系数分别为11.72%、9.43%、12.95%，均小于15%，精密性符合要求。

2.3.3 准确度 采用本研究制备的荧光层析试纸条检测高、中、低值回收率结果如表2所示，低、中、高值回收率分别为101.7%、101.2%、104.9%，均符合回收率85%～115%的要求。

表2 回收率检测结果（±s）Tab.2 Four-factor three-level experimental results（±s）

表2 回收率检测结果（±s）Tab.2 Four-factor three-level experimental results（±s）

Sample Recovery rate（%）Low value Median value High value Predicted concentration（ng/ml）3 10 17 Detection concentration（ng/ml）3.05±0.14 10.12±0.30 17.83±0.97 101.7 101.2 104.9

2.3.4 特异性 特异性检测结果如表3所示，与乳腺癌常见的血清标志物无明显交叉反应，表明试纸条特异性较好。

表3 特异性检测结果（±s，ng/ml）Tab.3 Specificity for hMAM detection（±s，ng/ml）

表3 特异性检测结果（±s，ng/ml）Tab.3 Specificity for hMAM detection（±s，ng/ml）

Cross-reaction substances CEA（20 ng/ml）CA153（50 U/ml）Theoretical concentration 15 15 Measured concentration 14.69±0.85 14.82±1.18

2.4 方法学比对 如图3所示，2种方法检测血清中hMAM的相关方程为y=1.036x-0.079，R2=0.982 2，表明两种方法相关性较好。

图3 荧光免疫层析法与ELISA法的相关性分析Fig.3 Correlation analysis between fluorescence

3 讨论

乳腺癌是一种肿瘤细胞可以在早期扩散到血液和淋巴系统的全身性疾病，由于血液样本相对容易获得，对肿瘤的早期且准确的非侵入性检测成为患者治疗和预后的重要因素［7］。对于乳腺癌，CA15-3和CEA是常见的标志物，但缺乏敏感性和特异性，且很少在严重疾病中升高。雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2在临床上是最有用的预后和治疗指标，但对诊断和进展无显著意义［8］。一种高灵敏度、高特异性的生物标志物对乳腺癌的正确诊断和预后评估至关重要［9］。hMAM是一种乳腺上皮细胞相关糖蛋白，在93%的乳腺癌中表达，血液中hMAM可在很早的阶段被检测到，且在早期乳腺癌中表达量最高［10-12］。有研究表明外周血中hMAM阳性与乳腺癌的诊断、监测治疗和临床预后存在显著相关性［13］。故建立hMAM快速检测技术对疾病诊断治疗具有重要意义。目前血清hMAM含量的检测主要有RT-PCR、ELISA等方法，RT-PCR检测灵敏性较高，但mRNA容易降解，操作较为复杂，而ELISA分析时间相对较长，不适合快速检测［14-16］。荧光免疫层析法由于具有操作简便、稳定性好、价格低廉等优点，成为近年来的研究热点［17］。

本研究建立了一种铕螯合荧光纳米微球免疫层析方法，采用时间分辨荧光技术利用波长和时间2个参数进行信号分辨，有效地排除非特异荧光的干扰，与传统的快速检测技术相比，该方法具有灵敏度高、定量检测范围广等优点。此外，本研究通过对荧光微球偶联工艺的优化，使得微球抗体偶联较均一、荧光信号强、精密性、准确性均较好，与ELISA试剂盒同时检测46例临床样本，相关性较好。综上所述，本研究建立的hMAM荧光免疫层析检测方法定量准确、简便、快捷，可为基层医院提供一种乳腺癌诊断和预后的辅助检测手段，适合临床推广应用。