液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱鉴定一种新精神活性物质5F-MDMB-PICA在斑马鱼体内的代谢产物

岳琳娜，严 慧，向 平，刘 伟*，宋粉云

(1.广东药科大学，药学院，广东 广州 510006；2.司法鉴定科学研究院，法医毒物化学研究室，上海 200063)

新精神活性物质又称“第三代毒品”，是不法分子通过对管制毒品进行化学结构修饰，或全新设计和筛选而获得的毒品类似物，具有与管制毒品相似或更强的危害性。合成大麻素(Synthetic cannabinoids,SCs)是模拟大麻植物主要活性成分四氢大麻酚(Δ9-THC)的化学作用而合成的一类化合物，通常具备更强大的危害性和成瘾性。据欧洲毒品和毒瘾监测中心(EMCDDA)报道：合成大麻素类是种类最多、滥用最为严重的一大类新精神活性物质[1]。

5F-MDMB-PICA(Methyl 2-[[1-(5-fluoropentyl)indole-3-carbonyl]amino]-3,3-dimethyl-butanoate)，中文名称3，3-二甲基-2-[1-(5-氟戊基)吲哚-3-甲酰氨基]丁酸甲酯，属于具有吲哚母核的新型合成大麻素衍生物[2-4]，其活性是Δ9-THC的380倍[5]。5F-MDMB-PICA在娱乐用途上越来越流行[6]，据美国国家法医实验室信息系统(NFLIS)报告，2016年～2018年间，已有340份报告包含5F-MDMB-PICA[7]。5F-MDMB-PICA引发了许多健康问题，包括胸痛、呼吸系统疾病、癫痫发作甚至造成死亡[8-9]。2018年，5F-MDMB-PICA在美国被列入管制列表[7]。目前5F-MDMB-PICA在我国尚未列入管制清单,鉴于其强效作用及可能的滥用趋势，可能会对公共安全构成严重威胁。

合成大麻素的母体结构通常很难在生物基质中检出，因此需要进行代谢研究，以便对新出现的合成大麻素滥用形势进行监测。Mogler等[10]通过人肝微粒体体外代谢模型研究5F-MDMB-PICA代谢产物，分析了吸毒者的尿样(n=24)，鉴定出12种I期代谢物。Truver等[11]通过人肝细胞孵育对5F-MDMB-PICA的体外代谢进行研究，共鉴定出22个代谢产物。尽管有5F-MDMB-PICA体内和体外代谢研究的信息，但对于这类物质的监测仍缺乏系统的体内分析方法和代谢数据的支撑。

近年来，斑马鱼(Zebrafish)在毒理学、药物筛选、行为遗传学和药物代谢等各个领域应用十分广泛[12-14]。斑马鱼与人的基因高度相似，同源性高达87%[15-16]。斑马鱼体内有内源性大麻素受体1(CB1)和大麻素受体2(CB2)，具有同人类及其他哺乳动物高度相似的药物代谢的相关酶，包括Ⅰ相代谢酶[17]和Ⅱ相代谢酶[18]。作为一个完整的生物，斑马鱼也能弥补体外模型系统在药物代谢研究方面的局限性。已有报道采用斑马鱼模型进行合成大麻素N-{[1-(环己基甲基)-1H-吲唑-3-基]羰基} -3-甲基-L-缬氨酸甲酯 (MDMB-CHMINACA)[19]、3-甲基-2-[1-(4-氟苄基)吲唑-3-甲酰氨基]丁酸甲酯(AMB-FUBINACA)[20]的体内代谢研究，研究表明斑马鱼可作为代谢研究的理想实验模型。本文旨在构建5F-MDMB-PICA斑马鱼体内的代谢模型，建立高效液相色谱-高分辨质谱分析方法探索其在斑马鱼体内的代谢方式及代谢途径，以期为其滥用提供方法和数据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

液相色谱系统：UltiMate 3000 UHPLC，质谱仪：Thermo ScientificTM Q-ExactiveTM组合型四极杆 Orbitrap(LC-Q-Orbitrap MS)，美国Thermo Fisher Scientific公司产品，配有电喷雾离子源(HESI-Ⅱ)及XcaliburTM3.1工作站；TDZ4-WS离心机(上海卢湘仪离心机有限公司)；XW-80A涡旋混合器(上海医大仪器有限公司)；Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)；Minspin高速离心机(德国Eppendorf公司)；超声波清洗器(深圳市洁盟清洗设备有限公司)。

5F-MDMB-PICA标准品(1 mg/mL,溶剂为甲醇，美国Cayman公司)；乙腈、甲醇(≥99.9%，美国Sigma-Aldrich公司)；甲酸、乙酸铵(98%，瑞士Fluka化学公司)；超纯水使用Mili-Q系统制备。

1.2 动物实验

将6条成年斑马鱼随机分为空白对照组和实验组两组，每组3条。空白对照组为不添加5F-MDMB-PICA的斑马鱼组，排除斑马鱼体内、水中以及实验试剂对原体化合物及代谢物的干扰。将5F-MDMB-PICA溶解于水中，斑马鱼在5F-MDMB-PICA(1 μg/mL)药液中暴露染毒24 h，随后转移到清水中清洗3次，安乐死处理后进行样品前处理。

1.3 样品前处理

将斑马鱼放入2 mL规格研磨管中，加入适量陶瓷珠，乙腈溶液300 μL，于Omni Bead Ruptor 24 Elite多功能样品均质器中冷冻研磨。研磨参数设置为：速度6 m/s，研磨时间20 s，停留时间40 s，循环10次。然后以12 500 r/min离心3 min，取上清液，经0.22 μm PTFE微孔滤膜过滤后，装入进样瓶待仪器分析。

1.4 实验条件

1.4.1 液相色谱条件色谱分离采用Agilent Eclipse plus C18柱(100 mm×2.1 mm,3.5 μm)，流速为0.3 mL/min；流动相A为20 mmol/L乙酸铵、5%(体积比)乙腈和0.1%(体积比)甲酸混合溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱设置为0 ～ 0.5 min，5% B；0.5 ～ 6.5 min，5%～95% B；6.5 ～ 11.5 min，95% B；进样量为5 μL；自动进样盘的温度为4 ℃。

1.4.2 质谱条件采用电喷雾电离正离子检测(ESI+)模式；喷雾电压为3.5 kV；离子传输管温度为350 ℃；鞘气流量为35 arb(arbitrary units)；辅助气流量为10 arb;鞘气、辅助加热气和碰撞气均采用高纯氮气；数据采集模式采用一级全扫描和自动触发二级扫描(Full MS scan-ddMS2)。

一级扫描数据采集参数设置为：分辨率为70 000，质荷比扫描范围为100～1 000m/z；自动增益控制(AGC)为3.0×106；最大注射时间(IT)为50 ms。二级扫描数据采集参数设置为：分辨率为17 500；自动增益控制(AGC)为1×105；最大注射时间(IT)为50 ms；归一化碰撞能量(Normalized collision energy，NCE)分别为20、40、60 eV。

使用XcaliburTM3.1工作站及Mass Frontier软件进行数据处理。代谢产物的推断依据为：m/z测量值与m/z理论值的质量偏差小于±5 ppm，适当的色谱峰和保留时间，MS2质谱图中的特征碎片离子，以及结合已报道的5F-MDMB-PICA及其结构类似物的代谢转化的文献。

2 结果与讨论

本研究在斑马鱼体内检测到5F-MDMB-PICA的22个代谢产物，包括15个Ⅰ相代谢产物和7个Ⅱ相代谢产物，其中 6个Ⅱ相代谢产物A1、A3、A5、A6、A7、A14为首次报道。22个代谢产物的质荷比m/z测得值与理论值的质量偏差均在±5 ppm以内。5F-MDMB-PICA的保留时间为7.18 min,22种代谢物的保留时间为4.18 ～ 6.44 min，根据保留时间将22个代谢产物标记为A1～A22(见表1)。5F-MDMB-PICA的Ⅰ相代谢产物和Ⅱ相代谢产物的色谱图及质谱图见图1和图2，5F-MDMB-PICA在斑马鱼体内的代谢转化途径见图3。

在22种代谢产物中，羟基化代谢产物有3种(A21、A6、A14)，脱烷基化代谢产物有5种(A17、A1、A3、A2、A13)，酯水解代谢产物有8种(A19、A12、A8、A22、A9、A11、A15、A10),氧化脱氟代谢产物有3种(A7、A18、A20)，酰胺水解代谢产物有2种(A4、A5)，羧基化代谢产物有1种(A16)。

表1 5F-MDMB-PICA在斑马鱼体内产生的22种代谢产物Table 1 22 metabolites of 5F-MDMB-PICA in zebrafish

*：MS-MS was not available due to low abundance(未获得二级质谱图)

图1 斑马鱼体内5F-MDMB-PICA及其I相代谢产物的色谱图及质谱图Fig.1 Extracted ion chromatograms and MS spectra of 5F-MDMB-PICA and phase-I metabolites of 5F-MDMB-PICA in zebrafish

图2 斑马鱼体内5F-MDMB-PICA的II相代谢产物的色谱图及质谱图Fig.2 Extracted ion chromatograms and MS spectra of phase-Ⅱ metabolites of 5F-MDMB-PICA in zebrafish

2.1 脱烷基化代谢产物的分析

A17是5F-MDMB-PICA脱烷基后产生的代谢物,测得其m/z为289.154 39，其质谱图中出现了m/z为144.044 49和257.128 27的特征碎片离子。A17的响应强度最高，为主要的代谢产物之一。生物样本中A17的检出不足以推断5F-MDMB-PICA的摄入，因为其可以通过2-[1-(4-氟丁基)-1H-吲哚-3-甲酰氨基]3,3-二甲基丁酸甲酯(4F-MDMB-BICA)的生物转化产生[21]。

A2、A13 的m/z分别为305.149 57和305.149 66，其与A17 相比分子质量分别增加了15.995 18，15.995 27，推测是A17分子中增加了1个氧原子为羟基化代谢物。结合A2、A13的MS2质谱图中分别出现了m/z为160.039 46和160.039 41的碎片离子,说明羟基化反应发生在吲哚环上，但难以确认羟基化的具体位点，故A2、A13是两个羟基化的同分异构体。

A1的m/z为481.182 04，比A2或A13增加了176 Da，生成了特征碎片离子m/z160.039 20，推测A1为A2或A13与葡萄糖醛酸结合得到的Ⅱ相代谢产物。

A3是A2或A13与硫酸共轭得到的Ⅱ相代谢物，测得其m/z为385.105 38，与A2或A13相比相对分子质量增加了80 Da，其主要碎片离子为m/z160.039 44(图2)。

2.2 酯水解代谢产物的分析

代谢物A19的m/z为363.207 70，比原型化合物5F-MDMB-PICA(m/z377.223 14)减小了14.015 44 Da，结合m/z为232.113 14、144.043 87碎片离子的结构，推测其是由原型酯水解得到的代谢产物。研究证实与5F-MDMB-PICA结构相似的合成大麻素2-[1-(4-氟丁基)-1H-吲唑-3-甲酰氨基]-3,3-二甲基丁酸甲酯(4F-MDMB-BINACA)[22],3,3-二甲基-2-[1-(5-氟戊基)吲唑-3-甲酰氨基]丁酸甲酯(5F-MDMB-PINACA)[23],3,3-二甲基-2-[1-(4-戊烯-1-基)-1H-吲唑-3-甲酰氨基]丁酸甲酯(MDMB-4en-PINACA)[24-25]的主要生物转化途径有酯水解，且酯水解代谢产物常被推荐作为毒性标记物。与此相同，酯水解(A19)也是5F-MDMB-PICA的主要生物转化方式，其在斑马鱼体内的浓度较大，是斑马鱼体内主要的代谢物之一(表1)。已有报道在多名5F-MDMB-PICA滥用者的尿样中均检出代谢物A19[10-11]，且与Ⅱ相代谢产物相比，Ⅰ相代谢物的检测无需经过酶水解等复杂的前处理过程，更适宜作为监测合成大麻素摄入的生物标记物，因此推荐A19作为检测5F-MDMB-PICA摄入的潜在毒性标志物。

A8的m/z为539.242 31，比A19增加了176 Da，其碎片离子m/z232.112 96、144.044 56与A19相同，推测A8为A19与葡萄糖醛酸结合得到的Ⅱ相代谢产物。

代谢物A12(m/z379.202 67)与A19的准分子离子相比相差15.994 97 Da，结合m/z为248.107 71、144.044 42碎片离子的结构，说明羟基化反应发生在5-氟戊基侧链上，但难以确认羟基化的具体位点。

A22的m/z为361.191 99，比A19减小了2.015 71 Da，结合m/z为232.113 14、144.044 63碎片离子的结构，推测A22是由A19脱氢得到的代谢产物。A9是由A22脱烷基得到的代谢物，产生了m/z为144.044 46的特征碎片离子。

A11的m/z为361.212 83，与A19相比减小了1.994 87 Da，结合m/z为230.117 49、144.043 95碎片离子的结构，推测A11是由A19发生氧化脱氟反应得到的代谢物。代谢物A10，测得其m/z为375.191 25，结合m/z为244.096 69、144.044 53的特征碎片离子，推测A10是由A11发生氧化反应得到的戊酸代谢物。

A15的m/z为359.195 43，与A11相比减小了2.017 4 Da，结合已报道的5F-MDMB-PICA在肝微粒体孵育中代谢转化途径[11]，推测A15是由A11脱氢后得到的代谢物。由于响应太低，未获得A15的MS2质谱图。

2.3 羟基化代谢产物的分析

A21的m/z为393.218 32，比原型增加了15.995 18 Da，结合m/z为248.107 99、144.044 27碎片离子的结构，可知羟基化的发生位点是5-氟戊基侧链，但难以确定具体位点。A6的m/z569.250 49与A21相比增加了176 Da，推测是由A21与葡萄糖醛酸结合得到的Ⅱ相代谢产物。A14的m/z为473.175 29，比A21增加了80 Da，其m/z为248.108 11、144.044 65的特征碎片离子与A21一致，推测是由A21与硫酸结合得到的Ⅱ相代谢产物。

2.4 氧化脱氟代谢产物的分析

A20的m/z为375.227 78，比原型5F-MDMB-PICA减小了1.995 36 Da，结合m/z为144.044 42、230.117 55的特征碎片离子，推测是由原型发生氧化脱氟反应得到的代谢物。A20进一步氧化生成戊酸A18，产生了m/z为244.096 66、144.044 24的特征碎片离子。

代谢物A7，测得其m/z为551.260 56，与A20相比增加了176 Da，m/z为230.117 54、144.044 45的特征碎片离子与A20一致，推测A7是由A20与葡萄糖醛酸结合得到的Ⅱ相代谢产物。

2.5 酰胺水解代谢产物的分析

5F-MDMB-PICA酰胺键水解后生成代谢物A4，测得其m/z为250.123 61。产生了m/z为206.134 03、118.065 10的特征碎片离子。

A5的m/z为426.154 47，与A4相比增加了176 Da，其m/z为206.134 17的特征碎片离子与A4一致，推测A5是由A4与葡萄糖醛酸结合得到的Ⅱ相代谢产物。

2.6 羧基化代谢产物的分析

A16的m/z为361.174 53，与原体相比减小了16.048 61 Da，结合已报道的5F-MDMB-PICA的代谢转化途径[10-11]，推测A16是由原型发生氧化脱氟反应后得到的丙酸代谢产物。由于响应太低，未获得A16的MS2质谱图。

3 结 论

5F-MDMB-PICA等合成大麻素在人体内代谢速率较快，在尿液中基本无原药检出，这为该类毒品滥用的监测工作带来了极大挑战。本文采用液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱技术，通过近年来药物代谢研究中较为流行的斑马鱼模型，研究鉴定出了5F-MDMB-PICA的22个代谢产物及主要代谢途径，其中6个Ⅱ相代谢产物为首次报道。本研究获得的5F-MDMB-PICA体内代谢数据、开发的5F-MDMB-PICA及代谢物的分析方法可应用于5F-MDMB-PICA的滥用监测，为临床上5F-MDMB-PICA的中毒诊治提供依据，也为法庭科学案件中这种新型精神活性物质滥用的打击和预防提供了技术支持。