牛肉低温储藏过程中水分迁移与蛋白质氧化的相关性研究

孙慧琳，代媛媛，孟兰奇，查恩辉

（锦州医科大学食品科学与工程学院，辽宁 锦州 121001）

牛肉中富含的蛋白质、氨基酸有修复组织以及提高机体抗病能力等功效。我国作为牛肉和牛肉制品的第三消费大国，近年来生产和销售量逐渐升高。储藏品质一直是牛肉屠宰企业及生产企业关注的问题，储藏温度不同，品质差异较大。冷藏是肉类目前最简单易行和最经济的储藏方式，冰温储藏消除了冰晶对食品的不良影响，包括蛋白变性以及冻害等危害，满足消费者对绿色、方便、具有较长货架期的冷鲜肉的需求。而影响牛肉品质的重要指标就包含蛋白质氧化以及水相的变化，刘泽龙[1]通过Fenton氧化体系对蛋白进行氧化，研究发现，肌肉的蛋白质氧化会影响其水合与持水能力。

蛋白质氧化会影响肉品的加工特性、营养价值及风味滋味，对肉制品品质影响极大。蛋白质氧化被定义为一种共价键修饰，能够造成蛋白质多肽链的断裂、氨基酸侧链被修饰以及蛋白质分子间发生交联聚合等一系列破坏蛋白质结构的作用，从而改变蛋白质乳化、溶解、起泡、凝胶等特性[2-3]，影响肉品品质。扶庆权等[4]研究发现，随着蛋白质氧化的程度加剧，肌细胞外围的羰基氧化荧光信号显著增加，表明羰基含量增加。Lund等[5]研究发现，一些自由基诱导物例如羟自由基（·OH）、过氧化自由基（HO2·）等和一些非自由基诱导物例如过氧化氢（H2O2）、次氯酸（HClO）和臭氧等均可诱导蛋白质氧化，且在不同储藏条件下猪肉的肌球蛋白重链发生不同程度降解，造成总巯基含量显著下降。

通过核磁共振（NMR）技术研究牛肉中水的迁移规律和分布状态，弛豫时间T2可以灵敏地区分多种相态的氢质子，并且能够反映牛肉内部氢质子所处环境以及氢质子所受的束缚力和自由度[6]。牛肉中存在3种水分状态，其含量的变化会对牛肉的品质产生影响，一般分为强结合水T2b（0.1～1 ms），弱结合水T21（1～10 ms），不易流动水T22（10～100 ms），自由水T23（100～1 000 ms）。Margit等[7]通过低场核磁共振技术检测鲜肉在冷冻储藏时的水相变化，研究发现，冻藏的时间及温度与肉样的持水性呈显著相关，冻藏的温度越高，时间越长，水分损失就越严重。戚军等[8]通过低场核磁共振技术发现羊肉经反复冻融后其保水性显著下降。

目前，已有国内外学者利用核磁共振技术检测牛肉品质，针对牛肉的水分迁移及蛋白质氧化的相关性略有研究。本文利用低场核磁共振技术研究牛肉在不同储藏温度下水分迁移与蛋白质氧化的相关性，目的是找到能够快速表征蛋白质氧化程度的检测方法，为牛肉储藏过程中的无损检测提供新思路和新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

牛背最长肌，购于锦州鲜肉批发市场。三氯乙酸、盐酸乙醇、氧化镁、氯化钠（分析纯（AR）），购于珠海丽珠试剂股份有限公司；磷酸氢二钠、氢氧化钠、乙酸乙酯、磷酸钠（均为AR），购于国药集团化学试剂有限公司；五水合硫酸铜、磷酸二氢钠、四水合酒石酸钾钠、EDTA、DTNB（均为AR），购于南京化学试剂有限公司；盐酸胍、DNPH、尿素、十二烷基硫酸钠（SDS）、牛血清蛋白（均为AR），购于成都市科龙化工试剂厂。

1.1.2 仪器与设备

BCD-258WLDPN冰箱，购于汉莎科学仪器有限公司；JJ5000A电子天平，购于华瑞科学仪器有限公司；UV-1800紫外分光光度计，购于上海谱元仪器有限公司；NMI20核磁共振成像仪，购于上海纽迈科技有限公司；JIDI-16D高速离心机，购于上海精密科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

选取宰后24 h内的牛背最长肌，去除筋膜后沿肌原纤维方向切成10 g左右肉块，使用PE保鲜膜包装后分别放置于避光的4℃冷藏室及-2℃冰温室，于包装后0、2、4、6、8、10 d取样测定各指标。

1.2.2 蛋白质的测定

1.2.2.1 肌原纤维蛋白的提取

将牛肉剔除脂肪后切碎，称取10.0 g肉样加入隔离缓冲溶液，冰浴条件下匀浆30 s。匀浆后离心15 min（5 000 r/min），弃掉上层清液。重复上述步骤两次。将得到的肌原纤维颗粒用0.1 mol/L氯化钠洗提3次，在最后1次离心前用4层纱布过滤，用0.1 mol/L的盐酸将pH调到6.0[9]。得到的沉淀为肌原纤维蛋白，密闭后置于冰上保藏，在24 h内用完。

1.2.2.2 蛋白含量的测定

将牛血清蛋白配制成10 mg/mL的标准溶液。分别取标准蛋白溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL加水至1 mL，加入双缩脲试剂至5 mL，涡旋后室温静置20 min，于540 nm波长下测定溶液吸光度，重复3次，结果取平均值[10]。经计算，回归方程y=0.049 1x+0.004 2，R2=0.999 7。

1.2.2.3 羰基含量的测定

将肌原纤维蛋白用0.1 mol/L的磷酸缓冲液稀释为2 mg/mL的肌原纤维蛋白溶液，取1 mL肌原纤维蛋白质溶液，加入1 mL DNPH溶液，空白对照则加入1 mL 2 mol/L盐酸溶液，在室温下暗室静置1 h。加入1 mL TCA溶液，离心5 min（13 000 r/min），收集沉淀，用体积比为1∶1的乙酸乙酯-乙醇混合溶液充分洗涤并离心3次，去除残留的试剂。溶剂挥发后，加入3 mL 6 mol/L盐酸胍溶液，38℃下水浴15 min后离心5 min（13 000 r/min），取上清液于370 nm波长下测定溶液吸光度[11]。采用摩尔消光系数22 000 L/(mol·cm)计算羰基含量。

式中：A370为370 nm下的吸光度；106为摩尔基础单位；C为测得的蛋白浓度（mg/mL）。

1.2.2.4 巯基含量的测定

准确吸取0.5 mL肌原纤维蛋白质溶液放入玻璃试管中，而空白对照则加入0.5 mL 0.1 mol/L磷酸钠缓冲液，然后加入2.0 mL尿素-SDS溶液、0.5 mL DTNB试剂。涡旋后暗室静置10 min，于412 nm波长处测定样品吸光度[12]。使用摩尔消光系数13 600 L/(mol·cm)来计算蛋白中总巯基含量。

式中：A412为412 nm下的吸光度；106为摩尔基础单位；C为测得的蛋白浓度（mg/mL）。

1.2.3 pH的测定

将肉样切成肉糜，称取5.0 g，放入盛有45 mL蒸馏水的锥形瓶中，混匀后振荡30 min，之后用pH计测定。重复3次，结果取平均值。

1.2.4 储藏损失率的测定

称量储藏前肉样质量（m1），分别进行冷藏、冻藏，到期取出肉样后，于室温下解冻，用滤纸吸净多余水分后称重（m2），计算储藏损失率。

1.2.5 水相迁移的测定

将2组肉样分别分割为1.0 g，体积约为10 mm×10 mm×20 mm后放入直径为15 mm、长为200 mm的低场核磁专用管内，排除内部空气后用保鲜膜封闭包装。将核磁管放入低场核磁共振仪中检测。磁体温度为32℃，质子共振频率为21 MHz[13]。选择CPMG脉冲序列，参数设定为：SF1=22 MHz、O1=911.887 4 kHz、P1=15μs、P2=30μs、τ=150μs、TD=90 016、Echo Cnt=3 000、NS=8、TR=1 000、RG1=30、RG2=3。每组样品做3个平行试验，每个平行重复测定3次。用Multi Exp Inv Analysis软件进行CPMG指数衰减曲线反演。

1.2.6 数据处理

采用EXCEL 2017分析pH、储藏损失率等指标的平均值和变化规律，绘制折线图，每个样品平行测定3次。数据处理用SPSS 13.0软件进行方差分析（ANOVA），通过Pearson相关系数分析NMR与羰基、巯基的相关性，显著水平设为α=0.05。

2 结果与分析

2.1 储藏期间牛肉蛋白羰基及巯基含量的变化

肌肉中所含的赖氨酸、脯氨酸等能被直接氧化形成羰基；烷氧自由基（CO·）与烷基过氧化物（COOH）通过α-酰胺化途径导致多肽骨架链β-断裂；赖氨酸易与还原糖反应生成羰基衍生物[14]，三种方式均可使羰基含量增多，所以可以通过测量羰基来衡量蛋白质氧化程度。储藏期间牛肉蛋白质中羰基的含量变化如图1所示。由图1可知，新鲜牛肉的羰基含量为0.62 nmol/mg Prot，随着储藏时间的延长，冷藏组和冰温组蛋白的羰基含量均呈现增长趋势，但氧化速度冷藏组大于冰温组。储藏至10 d时，冷藏组及冰温组的羰基含量分别为1.29 nmol/mg Prot和0.98 nmol/mg Prot。李茜[15]研究发现，托盘包装的牛肉冷藏10 d，羰基含量由1.35 nmol/mg Prot增长到2.60 nmol/mg Prot，冰温储藏10 d羰基含量由1.35 nmol/mg Prot增长到1.50 nmol/mg Prot。结果表明冷藏条件储藏的牛肉其羰基含量增加程度大于冰温储藏条件，该结论与本试验结果相符。

图1 不同储藏温度下牛肉蛋白质羰基含量的变化Fig.1 Changes of beef carbonyl contents at different storage temperatures

蛋白质分子中的蛋氨酸含有的硫原子易被氧化生成二硫键导致巯基含量降低；半胱氨酸被氧化成磺酸、亚磺酸、次磺酸，蛋氨酸被氧化成亚砜和砜[16]，也可导致巯基含量降低，所以可以通过测量巯基含量来衡量蛋白质氧化程度。储藏期间，牛肉蛋白质中巯基含量变化如图2所示。新鲜牛肉的巯基含量为79.92 nmol/mg Prot，在储藏过程中巯基含量总体呈现下降趋势。冰温组在储藏过程中巯基变化较为平稳，在储藏10 d后降为73.71 nmol/mg Prot，巯基含量损失约7%；冷藏组的巯基含量在储藏前期（0～6 d）变化不大，表明在储藏前期冷藏条件下的蛋白质空间结构相对稳定，储藏6 d之后，冷藏组巯基含量下降趋势增大，说明此时蛋白质结构出现剧烈变化，最终在10 d时降为70.73 nmol/mg Prot，巯基含量损失约11%。

2.2 储藏期间牛肉pH的变化

储藏期间牛肉pH的变化如图3所示。牛肉的pH在储藏前期（0～2 d）呈现下降趋势，是由于新鲜牛肉排酸不彻底，尸僵未结束，乳酸持续积累导致牛肉在储藏前48 h pH下降，48 h后出现自身解僵，pH上升。在冷藏4 d条件下pH上升是由于随着储藏时间的延长，乳酸逐渐被降解且牛肉表面的微生物活动加快，并在酶的作用下使蛋白质分解为氨、氨基酸等碱性物质[17]，从而使得牛肉pH上升。当肉类pH＞6.7即为变质，冷藏10 d的牛肉pH已达到6.78，此时牛肉已腐败变质，蛋白质不断被分解生成的碱性物质使pH增大。冰温储藏牛肉在0～4 d时pH下降，在4～10 d时pH上升，在第10天时pH达到6.05，变化趋势与冷藏牛肉一致，但变化较为平缓，原因是低温抑制有害微生物及病原菌的生命活动且在冰温条件下牛肉细胞稳定性高，理化性质改变速度较慢，所以不易腐败变质。

图3 不同储藏温度下牛肉pH的变化Fig.3 Changes of beef pH at different storage temperatures

2.3 储藏期间牛肉损失率的变化

储藏期间牛肉损失率的变化如图4所示。在储藏4 d时，冷藏条件下的牛肉比冰温条件下的牛肉储藏损失高1.4倍。在第10天时冰温组、冷藏组的储藏损失率分别为3.14%和4.31%。可能是由于冷藏组牛肉相较于冰温组，微生物生命活动相对旺盛，蛋白质变性速度加快，使牛肉细胞系水力降低，进而导致水分含量降低，而冰温组能很好地抑制微生物活动，从而降低了储藏损失率。牛肉中的水主要包含自由水、结合水和不易流动水，自由水最易损失，而储藏牛肉与新鲜牛肉相比损失的可能是自由水，且细胞内物质如氨基酸、核苷酸等风味成分和营养物质也会随着水分流失[18]。

图4 不同储藏温度下牛肉储藏损失率的变化Fig.4 Changes of beef storage loss rates under different storage temperatures

2.4 储藏期间牛肉中水分的存在状态及迁移规律

牛肉在不同储藏温度下水分分布的情况见图5和图6，一共出现4个波峰，第1个波峰出现在0.1～1 ms之间为强结合水（T2b），第2个波峰出现在1.0～5.0 ms之间为弱结合水（T21），结合水与牛肉紧密相连，以致储藏期间变化趋势不显著。第3个波峰在24～76 ms之间为不易流动水（T22），且第3个波峰面积占总体达到85%以上。第4个波峰在150～230之间为自由水（T23）。随着储藏时间的延长，4个波峰发生变化，说明不同状态水分发生了迁移或转变，由于T22减小，说明不易流动水逐渐转变为自由水。

图5 冰温条件下牛肉水分分布图Fig.5 Water distributions of beef in ice temperature

图6 冷藏条件下牛肉水分分布图Fig.6 Water distributions of beef in cold storage

牛肉在不同储藏温度下横向弛豫时间T2峰面积比的变化如表1所示。两种储藏温度下T22、T2b和T21弛豫时间的峰面积均呈现下降趋势，T23弛豫时间的峰面积呈现上升趋势，即牛肉中不易流动水及结合水含量降低，自由水含量增加。由此可知，在储藏期间牛肉内3种状态水分发生转移，一部分不易流动水转变为自由水。由图5～6可知，随着储藏时间的延长，-2℃条件下的牛肉T22、T23峰面积变化小于4℃条件，表明牛肉在冰温条件下有着较高的持水性[19]，间接表示冰温条件的保鲜效果优于冷藏。

表1 不同储藏温度下牛肉横向弛豫时间T2峰面积比的变化Table 1 Changes in T2 transverse relaxation times of beef under different storage temperatures

2.5 相关性分析

表2为通过Pearson法得出的牛肉在冰温储藏过程中水分迁移与蛋白质氧化之间的相关性。在-2℃条件下，T22与羰基含量呈极显著负相关（P＜0.01），与巯基含量呈显著正相关（P＜0.05）；T23与羰基含量呈显著正相关（P＜0.05），与巯基含量呈显著负相关（P＜0.05）。

表3为通过Pearson法得出的牛肉在冷藏过程中水分迁移与蛋白质氧化之间的相关性。4℃条件下，T2b与巯基含量呈显著正相关（P＜0.05），T21与羰基含量呈显著负相关（P＜0.05），T22与羰基含量呈极显著负相关（P＜0.01），T22与巯基含量呈显著正相关（P＜0.05），T23与羰基含量呈极显著正相关（P＜0.01）。

表2 牛肉冰温储藏期间水分迁移与蛋白质指标间的相关性分析Table 2 Correlation analysis between beef water migrations and protein indices during ice temperature storage

表3 牛肉冷藏期间水分迁移与蛋白质指标间的相关性分析Table 3 Correlation analysis between beef water migrations and protein indices during cold storage

新鲜牛肉的含水量为70%～75%，在储藏期间最易流失的部分为自由水。80%的自由水存在于肌原纤维和肌丝间，由肌纤维给予肌肉持水性。由于氧化后的肌原纤维横向紧缩，导致肌细胞径向减小且胞间距增加，从而使肌肉内水分扩散到肌纤维的空隙中，由于空隙中水分与肌肉的结合力不强，易被排除导致水分流失[20]。通过相关性分析得知，蛋白质氧化与横向弛豫时间T2呈现良好的相关性，可以通过低场核磁共振弛豫时间T2表征蛋白质的变化，且两种储藏温度下T22与羰基的相关性最佳，与巯基也表现出较好的相关性，因此用来表征蛋白质氧化程度效果最好。

3 结论

（1）随着储藏时间的延长，牛肉的pH、储藏损失率以及羰基含量上升，而巯基含量下降，冷藏第10天时牛肉pH达到6.78，已腐败变质。

（2）根据横向弛豫时间T2结果表明，结合水（T2b、T21）以及不易流动水（T22）含量下降，自由水（T23）含量升高。通过相关性分析得出，冰温条件下T22与羰基含量呈极显著负相关（P＜0.01），与巯基含量呈现显著正相关（P＜0.05）；T23与羰基含量呈显著正相关（P＜0.05），与巯基含量呈显著负相关（P＜0.05）。冷藏条件下T2b与巯基含量呈显著正相关（P＜0.05），T21与羰基含量呈显著负相关（P＜0.05），T22与羰基含量呈极显著负相关（P＜0.01），T22与巯基含量呈显著正相关（P＜0.05），T23与羰基含量呈极显著正相关（P＜0.01）。

（3）牛肉蛋白质氧化与水分迁移有良好的相关性，可以通过低场核磁共振弛豫时间T2表征蛋白质的变化，且T22用来表征蛋白质氧化程度效果最好。