温度对美洲黑石斑(Centropristis striata)幼鱼生长和免疫因子活力与相关基因表达的影响*

李伟业 徐志进 殷小龙 陈 爽 马雪彬 章 霞 邱豪军 张晓林 蒋霞敏

温度对美洲黑石斑()幼鱼生长和免疫因子活力与相关基因表达的影响*

李伟业1, 2徐志进2殷小龙2陈 爽2马雪彬2章 霞2邱豪军2张晓林3蒋霞敏1①

(1. 宁波大学海洋学院 宁波 315832; 2. 浙江省舟山市水产研究所 舟山 316000; 3. 浙江海洋大学 舟山 316022)

采用温度渐变的方法, 研究了18、22、26、30 °C共4个温度梯度对美洲黑石斑幼鱼[(73.74±3.76)g]生长及免疫因子活力的影响。结果表明, 温度对美洲黑石斑幼鱼的生长和存活均有不同程度的影响。在实验温度范围内, 随着温度的升高, 美洲黑石斑幼鱼最终体重、特定增长率(SGR)、日增重(DWG)、增重率(GBW)和增长率(GBL)均出现先升高后降低的趋势, 且部分温度组间差异显著(<0.05), 其中上述各项指标中, 温度22 °C组均最高, 与温度26 °C组差异不显著(>0.05), 而与温度18 °C、30 °C组存在显著性差异(<0.05); 幼鱼的饲料系数(FCR)随温度升高先降低后升高, 且部分温度组间差异显著(<0.05)。在成活率方面, 除温度30 °C组的成活率为82.2%, 显著低于其他温度组外(<0.05), 其他各温度组成活率均达到90%以上。温度对美洲黑石斑幼免疫相关酶活力和基因表达也存在一定影响。在实验第1 d时, 碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)和溶菌酶(LSZ)活力随温度的升高呈逐渐升高的趋势, 而在实验第60 d时, 碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)和溶菌酶(LSZ)活力随温度升高呈先升高后降低的趋势, 且22 °C和26 °C组显著高于18 °C和30 °C组(<0.05); 而超氧化物歧化酶(SOD)活力在实验第1 d时随温度的升高呈先下降后升高的趋势, 实验第60 d时超氧化物歧化酶(SOD)活力随温度的升高逐渐上升。温度也影响和基因的表达, 尽管实验期间各实验组和基因的表达变化未呈现明显的规律性, 但30 °C组和的表达量显著高于其他组(<0.05)。从以上结果可见, 温度对美洲黑石斑幼鱼的生长和免疫因子活力有一定影响, 综合实验鱼的生长和免疫因子实验数据, 美洲黑石斑幼鱼最适的生长温度应为22—26 °C。

温度; 美洲黑石斑; 生长; 免疫酶; HSP70; HSP90

美洲黑石斑(), 又称条纹锯鮨和黑锯鮨, 通称黑石斑, 商品名为翡翠斑或珍珠斑, 属鮨科(Serranidae)、石斑鱼亚科(Serraninae)、锯鮨属(), 原产于墨西哥湾水域、美国东岸及加拿大东南近海(雷霁霖等, 2007)。因其肉质丰腴、口感清爽, 适应性强、且易于接受配合饲料、养殖生长速度要比自然界快, 因此备受养殖界青睐, 美国水产养殖界将其定位为高价值鱼类和美洲杰出的候选养殖品种(卢继武等, 2006; 雷霁霖等, 2007)。从20世纪70年代开始, 国外相继对美洲黑石斑的地理分布、生物学特性、生殖习性等方面进行研究(Kendall, 1977; Link, 1980), 随后开展了美洲黑石斑繁育养殖方面的研究, 并发现在人工养殖条件下, 其生长速度比自然栖息地的鱼快许多倍, 认为养殖优势和市场优势非常突出, 养殖潜力巨大, 值得大力推广(Kim, 1987; Tucker, 1989)。国内在美洲黑石斑增养殖方面的研究起步稍晚, 首先由青岛三高大菱鲆研究所有限公司于2003年从美国东北沿岸引进美洲黑石斑鱼苗, 开启了美洲黑石斑增养殖研究的序幕, 并于2006年取得苗种规模化繁育的成功, 为我国美洲黑石斑养殖业的发展奠定了基础(王波等, 2003; 雷霁霖等, 2007)。目前, 美洲黑石斑已在我国温带海域, 尤其是浙江、福建海区开展了池塘、网箱、工厂化养殖(褚衍伟, 2004)。

温度是养殖水环境中重要的环境因子, 不仅影响水生动物的生长、发育和存活等, 还能显著影响其免疫系统(An, 2010)。不适的温度条件不仅抑制水生动物的生长, 也会破坏其免疫系统, 从而引发疾病, 造成养殖业严重损失(Wyban, 1995; Le Moullac, 2000)。国内外学者在鱼类方面开展了广泛的研究, 诸多研究表明温度对鱼类的生长、存活和抗病力均会产生显著的影响(Martı́nez-Palacios, 2002; Partridge, 2002; 李文龙等, 2017)。同样, 在养殖过程中发现, 温度对美洲黑石斑的生长、疾病也存在显著的影响, 在15—30 °C下表现出较好的生长性能, 但在高温养殖环境下又极易染病。然而, 目前关于温度对美洲黑石斑的生长和免疫因子的研究鲜见报道。因此, 本文在15—30 °C范围内选取了4个不同的温度, 研究美洲黑石斑幼鱼的生长、免疫相关酶活力及、基因表达的影响, 以期探究出美洲黑石斑适宜的养殖温度, 为美洲黑石斑的健康养殖提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验时间为2020年6—8月, 实验地点在浙江省舟山市水产研究所朱家尖基地。实验用鱼为人工繁育的美洲黑石斑幼鱼, 挑选健康、活力强、无畸形、大小相近, 体重(73.74±3.76) g, 体长(14.06±0.13) cm的美洲黑石斑幼鱼, 放于恒温实验房的圆形实验桶内, 实验桶规格为直径80 cm、高100 cm。实验用水为经消毒沉沙滤后的自然海水, 实验期间, 每天换水2次, 日换水率50%, 每天投喂2次配合饲料(天邦海水鱼配合饲料3号料), 投喂时间为09:00和16:00, 并于投喂后1 h吸污清底。水质条件为: 盐度26—28, pH 8.4±0.1, 氨氮<0.3 mg/L, 亚硝酸盐<0.1 mg/L, 溶解氧保持在5 mg/L以上。

1.2 实验方法

1.2.1 实验设计 实验现设18、22、26、30 °C四个温度梯度组, 每个温度梯度设3个平行, 各实验桶放30尾实验鱼。实验开始前, 将实验鱼在实验桶进行暂养, 暂养水温24 °C, 暂养7 d后按照1 °C/d升温或降温, 至各温度梯度后, 开始实验, 实验进行60 d。

实验期间, 观察并记录实验鱼的日常行为状态, 并在实验第1 d和第60 d测量鱼的体重、全长, 统计成活率; 再从各梯度组中随机取3尾鱼, 取血清和肝脏, 用于相关酶活力和基因表达测定。

1.2.2 样品制备 从每个实验组中随机取3尾鱼, 用MS-222麻醉后, 用一次性注射器(1 mL)从美洲黑石斑幼鱼尾静脉取血, 血液置于1.5 mL离心管中, 4 °C下静置4 h后, 以12000 r/min离心30 min, 取上清液, 即为血清样品。剪取鱼肝脏, 用预冷蒸馏水洗净, 滤纸吸干, 置于1.5 mL离心管中, 迅速液氮冷冻。所取样品均置于冰箱(–80 °C)中, 用于酶活和基因检测。

1.2.3 酶活测定 使用购自南京建成生物工程研究所试剂盒测定样品酶活力。碱性磷酸(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)活力采用微量酶标法, 活力单位为U/L; 溶菌酶(LSZ)活力采用比浊法测定, 活力单位为U/mL; 超氧化物歧化酶(SOD)活力采用比色法, 活力单位为U/mL。

1.2.4 基因表达检测 使用RNA提取试剂盒(天根)提取总RNA, 采用反转录试剂盒(TaKaRa), 按说明步骤合成cDNA。根据NCBI数据库中、基因序列, 使用primer 5.0设计两对特异性引物(表1)。用于荧光定量分析(qPCR), 选取作为内参基因(黄左安等, 2011)。使用TransStart Top Green qPCR Super Mix试剂盒(全式金)试剂盒对cDNA在实时荧光定量PCR仪(ABI 7300plus)上进行检测。

1.2.5 数据处理 实验期间美洲黑石斑幼鱼特定增长率(SGR)、日增重(DWG)、增长率(GBL)、增重率(GBW)、饲料系数(FCR)计算如下:

SGR=[(ln2–ln1)/]×100%, (1)

DWG=(2–1)/, (2)

GBL=(2–1)/1×100%, (3)

GBW=(2–1)/1×100%, (4)

FCR=/[(2–1)], (5)

式中,1、2为时间1、2时的体重(g);1、2为时间1、2时的全长(cm);为实验天数;为实验个体尾数;为总投饵量(g)。

表1 美洲黑石斑基因定量分析所用引物

Tab.1 Primers that were used in the q-PCR an alysis of C. striata

采用SPSS19.0统计软件对数据进行处理和分析, 用Duncan氏和T检验法进行显著性分析和多重比较, 数据结果采用平均值±标准误差(Mean±S.D.)表示,<0.05为差异显著,<0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 温度对美洲黑石斑幼鱼行为状态的影响

由表2可以看出, 不同温度下美洲黑石斑幼鱼的游动、摄食等行为状态相似。18、22和26 °C组的幼鱼活力强, 游动迅捷, 摄食凶猛, 抢食明显, 多分布于水体下层; 而30 °C组幼鱼活力和摄食均一般, 分布于水体各层。实验期间, 实验鱼的成活率较高, 除30 °C组的成活率为82.2%外, 显著低于其他组(<0.05), 其他组的成活率均高于90%。

2.2 温度对美洲黑石斑幼鱼生长的影响

由表3可见, 美洲黑石斑幼鱼的最终体重、最终体长、特定增长率(SGR)、日增重(DWG)、增长率(GBL)和增重率(GBW)随温度的升高呈先升高后降低的趋势。且部分温度组间差异显著(<0.05), 其中22 °C组最终体重、特定增长率(SGR)、日增重(DWG)、增长率(GBL)和增重率(GBW)均最大, 与26 °C组差异不显著(0.05), 而与温度18 °C、30 °C组存在显著性差异(<0.05); 而温度30 °C组的上述各项指标均最低, 与18 °C组差异不显著(0.05), 但与22 °C和26 °C组差异显著(<0.05)。美洲黑石斑幼鱼的饲料系数(FCR)随温度升高呈先降低后升高的趋势, 且部分温度组间差异显著(<0.05), 30 °C组的饲料系数()最高为1.835±0.044, 22 °C组的饲料系数()最低为1.443±0.033。

2.3 不同温度下美洲黑石斑幼鱼血清中的AKP活力变化

不同温度下美洲黑石斑幼鱼血清中的AKP活力见图1。由图1可知, 实验第1 d美洲黑石斑幼鱼血清中的AKP活力随温度的升高逐渐升高, 30 °C组最高为(28.42±0.99) U/L, 显著高于其他组(0.05), 18 °C最低为(19.59±0.99) U/L, 显著低于其他组(0.05), 而22 °C和26 °C两组间差异不显著(0.05)。实验第60 d美洲黑石斑幼鱼血清中的AKP活力随温度的升高呈先升高后下降的趋势, 26 °C组最高为(26.26±1.04) U/L, 且与22 °C组差异不显著(0.05)。18 °C和30 °C组实验第60 d的AKP活力均低于实验第1 d, 且存在显著性差异(0.05); 而22 °C和26 °C组实验第60 d的AKP活力均高于第1 d, 但差异不显著(0.05)。

2.4 不同温度下美洲黑石斑幼鱼血清中的ACP活力变化

不同温度下美洲黑石斑幼鱼血清中的ACP活力见图2。由图2可知, 实验第1 d美洲黑石斑幼鱼血清中的ACP活力随温度的升高逐渐升高, 30 °C组最高为(18.21±0.83) U/L, 显著高于18 °C和22 °C组(<0.05), 18 °C最低为(14.63±0.60) U/L, 显著低于其他组(<0.05), 而22 °C和26 °C两组间差异不显著(>0.05)。实验第60 d美洲黑石斑幼鱼血清中的ACP活力随温度的升高呈先升高后下降的趋势, 26 °C组最高为(16.70±0.62) U/L, 且与22 °C组差异不显著(>0.05)。各实验组第60 d的ACP活力均低于实验第1 d, 其中18 °C和30 °C组实验第60 d的ACP活力显著低于第1 d (<0.05); 而22 °C和26 °C组实验第60 d的ACP活力与第1 d差异不显著(>0.05)。

表2 不同温度下美洲黑石斑幼鱼的行为状态

Tab.2 The performance of juvenile C. striata in different temperatures

注: 同一列数据中上标字母不同表示显著差异(<0.05)

表3 不同温度下美洲黑石斑幼鱼的生长指标

Tab.3 Indicators to the growth of juvenile C. striata in different temperatures

注: 同一行数据中上标字母不同表示显著差异(<0.05)

图1 不同温度下美洲黑石斑幼鱼血清中的AKP活力

注: 图中不同小写字母代表同一时间下不同温度组间的表达差异(0.05), 不同大写字母代表同一温度组不同时间下的表达差异(0.05)

图2 不同温度下美洲黑石斑幼鱼血清中的ACP活力

注: 图中不同小写字母代表同一时间下不同温度组间的表达差异(0.05), 不同大写字母代表同一温度组不同时间下的表达差异(0.05)

2.5 不同温度下美洲黑石斑幼鱼血清中的LSZ活力变化

不同温度下美洲黑石斑幼鱼血清中的LSZ活力见图3。由图3可知, 实验第1 d美洲黑石斑幼鱼血清中的LSZ活力随温度的升高逐渐升高, 且各组间存在显著性差异(<0.05), 其中30 °C组最高为(202.85±4.00) U/mL, 18 °C组最低为(163.47±1.93) U/mL。实验第60 d美洲黑石斑幼鱼血清中的LSZ活力随温度的升高呈先升高后下降的趋势, 26 °C组最高为(169.82±2.26) U/mL, 与其他组差异显著(<0.05)。18 °C和22 °C组实验第60 d的LSZ活力均高于实验第1 d, 但差异不显著(>0.05); 而26 °C和30 °C组实验第60 d的LSZ活力均低于第1 d, 其中26 °C组差异不显著(>0.05), 而30 °C组存在显著性差异(<0.05)。

图3 不同温度下美洲黑石斑幼鱼血清中的LSZ活力

注: 图中不同小写字母代表同一时间下不同温度组间的表达差异(0.05), 不同大写字母代表同一温度组不同时间下的表达差异(0.05)

2.6 不同温度下美洲黑石斑幼鱼血清中的SOD活力变化

不同温度下美洲黑石斑幼鱼血清中的SOD活力见图4。由图4可知, 实验第1 d美洲黑石斑幼鱼血清中的SOD活力随温度的升高呈先下降后上升的趋势, 30 °C组最高为(174.44±1.25) U/mL, 显著高于其他组(<0.05), 22 °C组最低为(152.89±0.60) U/mL, 显著低于其他组(<0.05)。实验第60 d美洲黑石斑幼鱼血清中的SOD活力随温度的升高逐渐上升, 30 °C组最高, 为(195.54±4.21) U/mL, 且显著高于其他组(<0.05); 18 °C组最低, 为(145.48±2.76) U/mL, 且显著低于其他组(<0.05)。22、26和30 °C组实验第60 d的SOD活力均高于实验第1 d, 其中30 °C组实验第60 d的SOD活力显著高于第1 d (<0.05), 而22 °C和26 °C组实验第60 d的SOD活力与第1 d差异不显著(>0.05)。18 °C组实验第60 d的SOD活力均低于实验第1 d, 且存在显著性差异(<0.05)。

图4 不同温度下美洲黑石斑幼鱼血清中的SOD活力

注: 图中不同小写字母代表同一时间下不同温度组间的表达差异(0.05), 不同大写字母代表同一温度组不同时间下的表达差异(<0.05)

2.7 不同温度下美洲黑石斑幼鱼肝脏中HSP70基因的表达量变化

不同温度下美洲黑石斑幼鱼肝脏中基因的表达量见图5。由图5可知, 实验第1 d美洲黑石斑幼鱼肝脏中基因的表达量随温度的升高呈逐渐上升的趋势, 30 °C组最高, 且与其他组差异显著(<0.05)。实验第60 d美洲黑石斑幼鱼肝脏中基因的表达量随温度的升高呈先下降后上升的趋势, 其中30 °C组显著高于其他组(<0.05), 而22 °C组显著低于其他组(<0.05)。18、22和26 °C组实验第60 d的基因的表达量均高于实验第1 d, 且各组差异显著(<0.05), 而30 °C组实验第60 d的基因的表达量低于第1 d, 但差异不显著(>0.05)。

图5 不同温度下美洲黑石斑幼鱼肝脏中的HSP70基因的相对表达量

注: 图中不同小写字母代表同一时间下不同温度组间的表达差异(0.05), 不同大写字母代表同一温度组不同时间下的表达差异(0.05)

2.8 不同温度下美洲黑石斑幼鱼肝脏中HSP90基因的表达量变化

不同温度下美洲黑石斑幼鱼肝脏中基因的表达量见图6。由图6可知, 实验第1 d美洲黑石斑肝脏中基因的表达量随温度的升高呈逐渐上升的趋势, 30 °C组最高, 且与其他组差异显著(<0.05)。实验第60 d美洲黑石斑幼鱼肝脏中基因的表达量随温度的升高也呈先下降后上升的趋势, 其中30 °C组显著高于其他组(<0.05), 而22 °C组显著低于其他组(<0.05)。22 °C和26 °C组实验第60 d的基因的表达量均低于实验第1 d, 且各组差异显著(<0.05), 而18 °C组实验第60 d的基因的表达量高于第1 d, 但差异不显著(>0.05)。

3 讨论

3.1 鱼类适宜温度的因子筛选

温度是影响鱼类最重要的环境因素之一, 它能直接影响养殖动物的新陈代谢、生长和存活, 同样也对鱼类的免疫机能和抗病能力有显著影响(Imsland, 1996; An, 2010)。探究出鱼类适宜的温度范围对提升鱼类生长速度、有效预防病害发生、提升养殖效益具有显著的作用(雷霁霖等, 2007)。研究人员在探寻鱼类生长适温方面做了大量的研究工作, 主要从鱼类的表型性状、生理生化指标及基因表达变化等方面进行了研究。鱼类的生长性能、摄食和存活情况可直观反映自身的生存状态, 因此研究人员多通过上述指标探寻鱼类的适温范围, 如大菱鲆()、大泷六线鱼()、点篮子鱼()、斑点叉尾()等(Buentello, 2000; 高淳仁等, 2006; 胡发文等, 2012; 刘鉴毅等, 2015)。鱼类的自身状态从生理指标的变化也可以体现, 如研究人员对军曹鱼()、施氏鲟()、大菱鲆()通过研究抗氧化酶、消化酶、免疫相关酶的活力变化探寻鱼类的适宜生长温度(杨健, 2007; 白海文, 2012; 李文龙等, 2017)。诸多研究人员也通过基因表达的变化探寻鱼类适温范围, 如研究人员通过对大西洋鲑()的基因、布氏鲳鯵() GHRHR基因、黄姑鱼()基因在不同温度条件下的表达变化, 探究鱼类基因对温度的响应。可见, 通过研究表型性状、生理生化指标和基因等因子变化, 可有效了解鱼类的生存状态, 从而探寻出鱼类的适温范围。

图6 不同温度下美洲黑石斑幼鱼肝脏中的HSP90基因的相对表达量

注: 图中不同小写字母代表同一时间下不同温度组间的表达差异(0.05), 不同大写字母代表同一温度组不同时间下的表达差异(0.05)

3.2 温度对美洲黑石斑幼鱼生长的影响

适宜的水温变化对鱼类生长促进作用, 一定范围内升温有利于鱼类的生长发育, 而水温超过适宜温度后, 则往往会抑制鱼类的生长, 同时也会对摄食、成活造成影响(王小磊, 2001; 高淳仁等, 2006)。研究人员在温度对鱼类的影响方面已开展了大量的研究工作, 并发现温度变化对鱼类的生长性能有显著的影响。刘鉴毅等(2015)对点篮子鱼()的研究发现, 在19—31 °C范围内幼鱼的特定生长率(SGR)和相对增重率(WGR)随温度的升高而显著增加, 摄食率(FR)随着温度的升高而显著升高(<0.05), 认为点篮子鱼幼鱼快速生长的适宜温度范围为29.89—31.74 °C。胡发文等(2012)对大泷六线鱼()的研究结果表明, 温度变化对大泷六线鱼4月龄幼鱼存活与生长的影响显著(<0.05), 4月龄幼鱼存活与生长适宜水温为14—23 °C, 最适水温为17—23 °C, 在适温范围内幼鱼具有较高的存活率和生长率, 温度过高或过低均对其生长发育有抑制作用。高淳仁等(2006)研究发现不同温度对大菱鲆()幼鱼生长、成活率具有显著影响, 结果表明, 12—16 °C时, 其生长速度随温度的升高而加快, 且在此温度范围内摄食、生长较好, 成活率高也不易染病。曾本和等(2018)研究了水温对异齿裂腹鱼()存活、摄食和生长的影响, 结果表明水温与饲料系数、体质量增长率、体长增长率、特定生长率均为抛物线关系, 异齿裂腹鱼幼鱼在12—22 °C水温范围内均可存活、摄食及生长, 最适温度15.15—17.24 °C。李勇等(2011)研究发现高密度封闭循环海水养殖条件下大菱鲆摄食、生长和消化的适宜温度范围为16—18 °C, 适温范围内的最大摄食率为0.52%—0.55%。Buentello等(2000)研究发现, 斑点叉尾()的最适生长水温为22.8 °C, 在该温度下摄食量和饲料转化效率最高。从上述的研究可以看出, 温度的变化对鱼类生长、摄食和存活有显著的影响。本研究结果显示, 不同温度对美洲黑石斑幼鱼的生长影响显著(<0.05), 在温度18—30 °C范围内, 美洲黑石斑的最终体重、最终体长、特定增长率(SGR)、日增重(DWG)、增长率(GBL)和增重率(GBW)随温度的升高呈先升高后降低的趋势, 其中22 °C组最终体重、特定增长率(SGR)、日增重(DWG)、增长率(GBL)和增重率(GBW)均最大, 而温度30 °C组的上述各项指标均最低。美洲黑石斑的饲料系数(FCR)随温度升高呈先降低后升高的趋势, 且部分温度组间差异显著(<0.05), 22 °C组的饲料系数(FCR)最小, 30 °C组的饲料系数(FCR)最大。在18—26 °C范围内, 美洲黑石斑的成活率达90%以上。这表明, 美洲黑石斑在18—30 °C范围内均能生长存活, 而在22—26 °C范围内的生长性能最好。

3.3 温度对美洲黑石斑幼鱼免疫相关酶活力的影响

温度不仅影响鱼类的生长, 对其免疫功能也有显著的影响(Bly, 1992)。诸多研究表明, AKP、ACP、LSZ和SOD等酶是鱼类免疫防御体系中重要的酶, 可反映出鱼类机体的免疫状态(陈昌福等, 1990; Möck, 1990)。

AKP和ACP是鱼类免疫防御体系中比较重要的水解酶, 也是重要的代谢调控酶, 在防御异物侵入的机制中直接参与磷酸基团的转移和代谢, 形成水解酶体系, 在免疫反应中发挥作用(Muta, 1996; Yokota, 1982)。目前, 有关温度度变化对鱼类AKP和ACP活力的影响已研究较多。研究人员对大菱鲆(Huang, 2011)、草鱼()(张继平等, 2005)、施氏鲟()(刘红柏, 2004)、花()(方美娟等, 2010)、罗非鱼()(强俊等, 2012)等鱼类的研究发现, 温度对AKP和ACP的活力有显著影响, 且均随水温呈先升高后降低的趋势。本研究发现, 实验第60 d美洲黑石斑幼鱼血清中的AKP和ACP活力与上述研究结果一致, 随温度升高呈先升高后降低的趋势, 而实验第1 d美洲黑石斑幼鱼血清中的AKP和ACP活力呈逐渐升高的趋势。这可能在实验开始时, 受温度的影响, 美洲黑石斑幼鱼血清中的AKP和ACP的活力随着温度的升高出现短暂的活力增强, 以提升自身的免疫力; 而当美洲黑石斑幼鱼长期处于高温下, 由于其免疫能力的下降, 血清中的AKP和ACP活力也降低。同时, 实验第60 d, 美洲黑石斑幼鱼AKP和ACP的活力在22 °C组和26 °C组显著高于18 °C组和30 °C组, 这也表明, AKP和ACP的活力在适宜的温度下活力最强, 温度过低或过高都会使AKP和ACP的活力降低, 致使实验鱼免疫力下降。

LSZ是吞噬细胞杀菌的物质基础, 对机体的抗炎、修复和再生等过程中具有重要作用, 溶菌酶(LSZ)活力是衡量水生动物免疫状态的一个重要指标(Möck, 1990)。温度对鱼类机体内LSZ的变化有显著的影响, 研究人员对大西洋庸鲽(L.) (Langston, 2002)、草鱼(陈昌福等, 1990; 杨先乐等, 1997)、虹鳟() (向建国等, 2008)的研究发现, 在适宜范围内, LSZ活力随温度的升高而升高, 超过适宜温度, LSZ活力有下降趋势。本研究发现, 实验第60 d美洲黑石斑幼鱼血清中的LSZ活力与上述研究结果一致, 随温度升高呈先升高后降低的趋势, 而实验第1 d美洲黑石斑幼鱼血清中的LSZ活力呈逐渐升高的趋势。这可能在实验开始时, 在高温刺激下, 美洲黑石斑幼鱼血清中的LSZ的活力增强, 以提升自身的免疫力, 这也与Huang对大菱鲆的研究结果一致(Huang, 2011); 而实验第60 d的研究结果表明, 当美洲黑石斑幼鱼长期处于不适的温度下, 由于其免疫能力的下降, LSZ活力也降低。

SOD是鱼类机体重要的抗氧化酶, 可有效清除机体内的氧自由基, 在提升吞噬细胞防御能力和机体免疫功能中发挥重要作用, 通过检测 SOD的活力能够比较准确地反映机体内自由基的代谢及组织的氧化损伤情况(Nichols, 2000; 覃川杰等, 2011)。目前, 有关温度变化对鱼类SOD酶活力的影响已研究较多, 而不同鱼类SOD酶活力的变化情况却不尽相同。对大菱鲆(Huang, 2011; 李文龙等, 2017)、罗非鱼() (强俊等, 2012)、褐牙鲆() (徐冬冬等, 2010)等鱼类的研究发现, SOD活力随温度的升高先上升后下降; 而对军曹鱼() (杨健等, 2007)、金鱼() (Lushchak, 2006)、大弹涂鱼() (Liu, 2006)等鱼类的研究发现, SOD活力随温度的升高先逐渐上升。本研究发现, 实验第60 d美洲黑石斑幼鱼血清中的SOD活力与后者研究结果一致, 随温度升高逐渐上升, 而实验第1 d美洲黑石斑幼鱼血清中的SOD活力呈先下降后升高的趋势。这可能在实验开始时, 实验鱼为适应温度的变化, 通过提升SOD活力, 增强对环境的适应性。而实验第60 d的不同温度组实验鱼的SOD变化趋势, 可能是因为实验温度范围内, 美洲黑石斑幼鱼的耗氧率随环境温度的升高而升高, 氧自由基的产生也随之增加, 机体SOD活力的增强可降低氧化氢, 从而消除氧化损伤。

3.4 温度对美洲黑石斑幼鱼免疫相关基因的影响

是生物机体内的一种分子伴侣, 调节细胞的生理功能, 提高细胞对应激反应的耐受性, 避免生物体遭受氧化应激伤害, 常作为反映机体细胞功能态和抗应激能力的指标之一(Bond, 1987; Parsell, 1993)。和是重要的家族成员(冯起国, 1998)。诸多研究表明温度变化对鱼类机体内的表达具有显著的影响, 如研究人员对大西洋鲑() (Takle, 2005)、西伯利亚鲟() (田照辉等, 2013)、鲤鱼() (王云彪, 2008)、黄姑鱼((罗胜玉, 2016)等研究发现, 在温度急性刺激下,或基因均有显著的变化。但上述研究, 多为短时间的温度刺激, 而长时间实验对象的养殖条件下的研究报道鲜见。本研究发现, 实验第0 d和第60 d, 各实验组美洲黑石斑幼鱼的和基因的表达变化未呈现明显的规律性, 但30 °C组美洲黑石斑幼鱼的和基因的表达量在实验第0 d和第60 d均显著高于其他组, 表明美洲黑石斑幼鱼在30 °C条件下机体反应强烈, 通过提高和基因的表达量, 以提升自身的抗高温能力, 但和基因长时间的上调表达耗能巨大, 导致美洲黑石斑幼鱼免疫力下降, 也致使成活率降低, 从实验结果来看, 也发现30 °C组实验鱼的成活率最低。这与周鑫等(2013)对草鱼的研究结果较为一致。

4 结论

本研究结果表明, 温度对美洲黑石斑幼鱼的生长和免疫因子活力均有一定的影响。根据实验鱼的生长和免疫因子实验数据, 结合美洲黑石斑幼鱼的实际生活环境, 本文作者认为美洲黑石斑幼鱼最适的生长温度应为22—26 °C。

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EFFECTS OF TEMPERATURE ON GROWTH, IMMUNE FACTOR ACTIVITY AND RELATED GENE EXPRESSION OF JUVENILE

LI Wei-Ye1, 2, XU Zhi-Jin2, YI Xiao-Long2, CHEN Shuang2, MA Xue-Bin2, ZHANG Xia2, QIU Hao-Jun2, ZHANG Xiao-Lin3, JIANG Xia-Min1

(1. School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315832, China; 2. Zhoushan Fisheries Research Institute of Zhejiang Province, Zhoushan 316000, China; 3.Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China)

Using the temperature gradient method, we studied The effects of temperature gradients of 18, 22, 26, and 30 °C on growth and immune factor activity of juvenile[(73.74±3.76) g]. The results indicate that temperature affected the growth and survival of the juveniles in a different degree. With the increase of temperature, the final body weight, final body length, specific growth rate (SGR), daily weight gain (DWG), weight gain rate (GBW) and growth rate (GBL) of the juvenile fish showed a trend of first increasing and then decreasing, but significant differences were shown among groups (<0.05). The 22 °C group showed the best performance in all the above indicators so did similarly in group at 26 °C, but the 18 °C and 30 °C groups. The feed coefficient of juveniledecreased first and then increased with the increase of temperature, and the among-group difference was significant (<0.05). In survival rate, the 30 °C group was the lowest (82.2%), which was significantly lower than those of other groups were (<0.05) (>90%). Temperature had also a certain effect in terms of the activity of immune-related enzymes and gene expression in the juveniles. The activities of alkaline phosphatase (AKP), acid phosphatase (ACP) and lysozyme (LSZ) gradually increased with the temperature on the 1th Day of the experiment, and first increased and then decreased with the temperature increasing on the 60th day of the experiment. Moreover, the above-mentioned activities in 22 °C and 26 °C groups were significantly higher than those in 18 °C and 30 °C groups (<0.05). The activity of superoxide dismutase (SOD) decreased first and then increased with the increase of temperature on the 1th day of the experiment, and gradually increased with the increase of temperature on the 60th day of the experiment. Temperature also affected the expressions ofand. Although the expressions in each experimental group did not show obvious regularity, the expression levels in the 30 °C group were significantly higher than those in other groups (<0.05). Therefore, temperature affected obviously the growth and immune factor activity of juvenile. The experimental data show that the optimal growth temperature of juvenilewas 22—26 °C.

temperature;; growth; immune enzyme;;

* 浙江省重点研发计划项目, 2019C02048号; 舟山市公益类科技项目, 2019C31053号。李伟业, 博士研究生, E-mail: 17536260@qq.com

蒋霞敏, 博士生导师, 教授, E-mail: jiangxiamin@nbu.edu.cn

2020-09-25,

2020-10-22

S965.329

10.11693/hyhz20200900257